[发明专利]一步法合成莱鲍迪苷M的方法

权利要求书

1.一步法合成莱鲍迪苷M的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将能够分泌表达糖基转移酶UGT1的重组菌1和能够分泌表达糖基转移酶UGT2的重组菌2混合接种在含有甲醇的培养基中培养2h-3天，所述重组菌1和重组菌2接种时的细胞浓度的比为 1:0.7-2 ，重组菌1和重组菌2的总浓度控制在菌液的吸光值OD600为1，含有甲醇的培养基的pH=5.5-8，含有甲醇的培养基中甲醇的体积浓度为0.5%-1.5%；

（2）向步骤（1）获得的培养液中加入终度为0.5-20g/L底物莱鲍迪苷A，加入终浓度为0.2-1.5mM尿苷二磷酸葡萄糖，加入终浓度为0.5-5mM的硫酸镁或氯化镁，每24小时加入终浓度为0.5%-1.5%的甲醇，反应,得到莱鲍迪苷M；

所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述糖基转移酶UGT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述重组菌1用下述步骤构建：将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的糖基转移酶UGT1基因连接至表达载体pPICZalphaA，获得SEQ ID NO.3所示的4954bp的pP-UGT1质粒，pP-UGT1质粒包含信号肽alpha因子，所述的信号肽alpha因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；从含有pP-UGT1的重组大肠杆菌中提取该质粒，用PmeI酶切成线性的SEQ ID NO.3所示的4954bp片段，并转入宿主细胞1获得第一种重组菌1；

所述重组菌2用下述步骤构建：将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的糖基转移酶UGT2基因连接至表达载体pPICZalphaA，获得SEQ ID NO.6所示的4861bp的pP-UGT2质粒，pP-UGT2质粒包含信号肽alpha因子，所述的信号肽alpha因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；从含有pP-UGT2的重组大肠杆菌中提取该质粒，用PmeI酶切成线性的SEQ ID NO.6所示的4861bp片段，并转入宿主细胞1获得第一种重组菌2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述宿主细胞1为巴斯德毕赤酵母。