[发明专利]一株产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及该酶的生产方法。所述菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SJ‑215，保藏编号为CGMCC NO.18645。同时本发明并优化了相应的发酵机制，该发酵机制，发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低，发酵酶活力平均在65000U/mL以上；由本发明生产的中性蛋白酶酶活力高、热稳定性好、性能稳定，具有广泛的应用前景。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及该酶的生产方法。

背景技术：

蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可以将大分子的蛋白质水解成为氨基酸和小肽等产物。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。外肽酶是从蛋白质分子的游离氨基酸或羧基的末端逐个将肽键水解，进而游离出氨基酸，前者称为氨基肽酶，后者称为羧基肽酶。按其活性中心可以将其分为巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。按其反应的最适pH值，可以将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

其中，中性蛋白酶作用条件温和，可以将其应用于制药、食品、皮革、纺织和化工行业，但是由于其热稳定性差，限制了它的工业化生产和广泛应用。高温中性蛋白酶具有良好的热稳定性，弥补了一般中性蛋白酶的不足，生产和使用条件简单，因而具有更加广阔的应用前景。

由于酸性蛋白酶和碱性蛋白酶所要求的反应条件限制了它的广泛应用，所以自20世纪 70年代至今，研究和生产高温中性蛋白酶成为了酶学领域研究的热点之一。目前国外高温中性蛋白酶研究主要是集中在分子生物学与基因工程菌的构建，国内主要是集中在菌种的选育、酶的固定化技术、酶的分子生物学特性等方面的研究。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供一株能够生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，同时改进了发酵工艺，提高产中性蛋白酶的酶活，对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。

本发明首先提供一株生产耐高温中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株由本实验室保存的一株枯草芽孢杆菌经物理和化学复合诱变后获得，具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SJ-215，该菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.18645。

本发明还提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SJ-215的发酵产酶方法，具体如下：

(1)发酵培养

a.发酵罐培养基：玉米淀粉8％、蛋白胨0.41％、NaNO₃ 0.6％、KH₂PO₄ 0.2％、KCl0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃1％，pH 6.3；

b.发酵罐灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌35min；

c.发酵罐发酵工艺条件：2-4％接种量，罐压0.05-0.08MPa，培养温度30-32℃，搅拌转速 200-220r/min，pH控制6.2-6.4；通风量：1-1.5vvm；

(2)补料培养

培养基质量体积百分比组成如下：

a.补料培养基：玉米淀粉30％，玉米浆3％，氯化钙0.5％，pH 6.3。

b.补料培养基灭菌工艺条件：121℃-124℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

c.补料方法：发酵培养期间，当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.2-6.4；

(3)放罐