[发明专利]经基因组编辑的细胞的制造方法

权利要求书

1.一种仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，包括将(A)和(B)导入细胞的工序，

所述(A)为选自由(a1)在间隔序列的5’末端添加有1个以上核苷酸残基的向导RNA、(a2)包含相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基错配的间隔序列的向导RNA、及(a3)所述(a1)或所述(a2)的向导RNA的表达载体组成的组中的至少1种，

所述(B)为选自由Cas蛋白及其表达载体组成的组中的至少1种。

2.根据权利要求1所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，所述(A)是在间隔序列的5’末端添加1个以上核苷酸残基且所述间隔序列是相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基错配的间隔序列的、向导RNA或编码该向导RNA的表达载体。

3.根据权利要求1或2所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，被添加至所述间隔序列的5’末端的核苷酸残基全部为相同的核苷酸残基。

4.根据权利要求3所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，被添加至所述间隔序列的5’末端的核苷酸残基为胞嘧啶残基或鸟嘌呤残基。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其还包括将(C)供体载体导入细胞的工序。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造方法，其中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。

7.一种向导RNA，其在间隔序列的5’末端添加有1个以上的核苷酸残基。

8.根据权利要求7所述的向导RNA，其中，所述间隔序列相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基的错配。

9.一种权利要求7或8所述的向导RNA的表达载体。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其还能表达Cas蛋白。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。

12.一种仅单侧等位基因经基因组编辑的细胞的制造试剂盒，其中，包含(A)，所述(A)为选自由(a1)在间隔序列的5’末端添加有1个以上核苷酸残基的向导RNA、(a2)包含相对于靶序列具有1个碱基或多个碱基错配的间隔序列的向导RNA、及(a3)所述(a1)或所述(a2)的向导RNA的表达载体组成的组中的至少1种。

13.根据权利要求12所述的制造试剂盒，其中，还包含(B)，所述(B)为选自由Cas蛋白及其表达载体组成的组中的至少1种。

14.一种基因组编辑模式的预测方法，包括：

(i)将向导RNA或其表达载体、以及Cas蛋白或其表达载体导入细胞而进行基因组编辑的工序；

(ii)从进行了所述基因组编辑的细胞中提取DNA的工序；

(iii)从所述DNA扩增包含靶区域的DNA片段的工序；

(iv)对所述扩增的DNA片段进行序列分析，求出对所述靶区域的indel诱导率(P)的工序；以及

(v)根据下述式(m)或(m1)以及(b)或(b1)，求出对仅单侧等位基因的indel诱导率(mono)及对两侧等位基因的indel诱导率(bi)的工序，

mono＝2×P×(1-P)···(m)

bi＝P²···(b)

mono＝-1.303P²+1.2761P+0.0274···(m1)

bi＝0.6515P²+0.3619P-0.0137···(b1)。