[发明专利]一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取及冻干粉制备方法

说明书

本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取方法，首先收集鳄鱼脂肪干细胞；对收集到的鳄鱼脂肪干细胞在无血清培养基中进行培养，取上清液超高速离心，沉淀物即为鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体。本发明还公开了鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体冻干粉的制备方法，向鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体中加入冻干赋形剂，然后依次经过冷藏和两次冷冻干燥即得。本发明采用无血清培养基培养，未加入血清类成分，避免了动物病原对于干细胞污染的可能性，及外来添加剂对人体和皮肤的伤害；本发明制备得到的冻干粉，产品性质更加稳定，能够更长久地发挥其生物活性。

技术领域

本发明涉及鳄鱼的深加工提取技术领域，具体地说，涉及一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取及冻干粉制备方法。

背景技术

外泌体（exosome）是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，其具有脂质双层膜结构，科学家们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。而且研究还发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。

鳄鱼骨、肉、血、油、内脏、脂肪等全身各部富含蛋白质、DHA、卵磷脂、不饱和脂肪酸、铁锌 磷镁等10种微量元素、18种以上氨基酸及维生素A、维生素E等，是一种科研价值、经济价值较高的动物。

目前市面上鳄鱼的用途最多的多为鳄皮制品，对鳄鱼骨、肉、血、脂肪的应用并不广泛， 因其资源的稀缺性，使得鳄鱼资源的应用更显珍贵，而对鳄鱼系列产品生物学及营养学的精细化深开发以及研究应用在全球更是少之又少。

因此，从鳄鱼脂肪干细胞中提取外泌体是一个制得研究的问题，也将是今后具有重要探讨价值的研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取方法，该方法步骤简单，便于操作，成本低且提取效果稳定。

本发明的第二个目的是提供一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体冻干粉的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，收集鳄鱼脂肪干细胞；

步骤2，对步骤1收集到的鳄鱼脂肪干细胞在无血清培养基中进行培养，取上清液超高速离心，沉淀物即为鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体。

进一步地，步骤2中将收集到的鳄鱼脂肪干细胞在无血清培养基中进行培养，具体方法为：将鳄鱼脂肪干细胞加入到无血清培养基中，培养5～8天，每天收集上清液，并更换新鲜的培养基。

进一步地，步骤2中超高速离心的具体步骤为：

a.将经过无血清培养基培养收集的上清液在4～6℃下，以300～400g离心10～15min，留上清液，弃去沉淀；

b.将a步骤所得上清液在4～6℃下，以1800～2500g离心10～20min，留上清液，弃去沉淀；

c.将b步骤所得上清液在4～6℃下，以10000～12000g离心25～30min，留上清液，弃去沉淀；

d.将c步骤所得上清液在4～6℃下，以100000～150000g离心65～75min，弃去上清液，保留沉淀；