[发明专利]用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用

说明书

本发明公开了用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用，综合检测单核苷酸重复位点BAT‑26、BAT‑25、NR‑21、NR‑24、NR‑27、Mono‑27，用于血浆CtDNA中MSI的检测，为了提高6个单核苷重复位点检测灵敏度，对其位点进行特殊的设计，对于blocker引物3’端的修饰进行体系筛选，最终确定ddC 3’端修饰，能够打破常规测序检测灵敏度低(灵敏度20％左右)的瓶颈，能够简单快速且检测灵敏度达到突变低于1％的检测方法，最终本发明对于MSI的检测不仅提高其在组织中的检测性能，同样依靠其超灵敏性应用到血浆CtDNA中MSI的检测。

技术领域

本发明属于基因检测的技术领域，具体涉及一种用于检测血浆中游离微卫星不稳定状态的组合物及其应用。

背景技术

目前，微卫星是由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记应用广泛。在肿瘤细胞中，错配修复系统中相关基因(Mismatch Repair,MMR)缺失时,可导致微卫星重复序列不稳定(微卫星突变)，导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)。根据MSI不稳定的程度，可分为微卫星高度不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)，微卫星低度不稳定(microsatellite instability-low,MSI-L)和微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)型。

结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)发生的遗传因素包括染色体不稳定性(Chromosome Instability,CIN)和微卫星不稳定性(Microsatellite Instability,MSI)。约80-85％的CRC由CIN引起，包括家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatouspolyposis,FAP)(APC基因胚系突变)和散发性CRC(APC、P53、DCC、KRAS等基因突变)；而另外15-20％的CRC则主要是由MSI引起，包括遗传性非息肉病性结直肠癌(HereditaryNonpolyposis Colorectal Cancer,HNPCC，又称Lynch综合征)(错配修复基因胚系突变)和散发性MSI(+)CRC(错配修复基因MLH1基因启动子甲基化)。

MSI表现为同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。近年来的大量研究表明：MSI与肿瘤发生密切相关，如结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等。尤其是结直肠癌，临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物。据文献报道，大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI-H的II期结直肠癌患者预后较好，但从5-FU辅助化疗获益较少。

Lynch综合征，亦称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，是由MMR基因胚系突变所致的显性遗传病。90％以上的Lynch综合征具有MSI特征，而散发性结直肠癌中只有约15％，所以临床上可用MSI检测来进行Lynch综合征的筛查。

2015年在新英格兰医学杂志发表的NCT01876511研究结果表明，PD-1单抗治疗对MSI-H的mCRC表现出高缓解率，因此PEMBRO单抗治疗MSI-H的mCRC获得FDA突破性疗法认定。2016年ASCO年会上发布的CheckMate-142，Ⅱ期研究的数据表明，MSI-H的mCRC患者不仅可从PD-1免疫治疗获益，而且对PD-1和CTLA-4联合治疗的临床活性和生存期都远远超过了单独使用PD-1的疗效。2017年5月23日，美国FDA批准了默沙东公司的“明星”PD-1抗体pembrolizumab(商品名：Keytruda)用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤，具体来说，Keytruda被批准用于治疗携带“MSI-H/dMMR亚型”的成人和儿童实体瘤患者。