[发明专利]一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法

权利要求书

1.一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；

2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热灭活，作为灭活酶液；

3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；

4)酶标板的酶标孔中分别加入酶活待测液和灭活酶液，再分别加入含有4-MUB-β-D-纤维素二糖苷的荧光底物工作液进行反应，随后加入终止液终止反应；

5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；

6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；

7)计算酶活待测液的稀释因子；

8)计算酶活待测液的比酶活。

2.根据权利要求1所述的检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将待测凋落物剪碎过2mm筛，每个样品称取3个0.15g分别加入3个离心过滤管中，分别加入600μL pH4.5的培养缓冲液，在4℃下孵育60min后，4℃下16000×g离心30min得到酶滤液后并混合，用培养缓冲液调节体积至4mL，制得酶活待测液；

2)从步骤1)制备的酶活待测液吸取1mL，在避光条件下85℃加热2h，冷却至室温，得到灭活酶液；

3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；

4)在黑色酶标板上，将33.3μL酶活待测液加入样品孔，将33.3μL灭活酶液加入阴性对照孔；再将600μM荧光底物工作液，即600μM 4-MUB-β-D-纤维素二糖苷溶液，按每孔66.7μL加入到所述样品孔和阴性对照孔中；在避光22℃的条件下160rpm震荡孵育反应30min后，迅速向所有样品孔和阴性对照孔中加入100μL pH10-11的1M Tris终止液终止反应；

5)采用多功能酶标仪对步骤4)反应结果进行荧光检测；

6)以MUB荧光标准物质溶液的梯度浓度和测定的对应吸光值A绘制出荧光标准曲线，得到标准曲线斜率b；

7)计算待测样品的稀释因子D＝(200μL*4mL)/(33.3μL*X)，200μL为100μL的反应液加100μL终止液体积，4mL为培养缓冲液调节混合酶滤液后的酶活待测液体积，33.3μL为100μL反应液中加入的酶活待测液体积，X为混合酶滤液的体积；

8)计算待测样品的比酶活：(A_活-A_阴)*D/(b*t*m)，比酶活单位为pmol/min/g，A_活为样品酶活反应液的吸光值，A_阴为样品对应灭活酶液的吸光值，D为稀释因子，b为标准曲线斜率，t为震荡孵育时间15min，m为3个离心过滤管凋落物的干重，单位为g。

3.根据权利要求1或2所述的检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养缓冲液，其制备方法为：将6.05gTris、7.8g马来酸、7.0g柠檬酸或7.65g一水柠檬酸、3.12g硼酸，和244mL 1M氢氧化钠，用去离子水定容至500mL得到通用缓冲液原液，再将所述通用缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃贮存，作为培养缓冲液备用。

4.根据权利要求2所述的检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，其特征在于，步骤3)具体为：称取8.8mg MUB溶入1mL乙二醇单甲醚中，再加入4mL无菌去离子水混合均匀，制成MUB母液；取20μL上步MUB母液用无菌去离子水稀释体积至20mL作为校准液，其浓度为10μM，避光4℃保存一周内备用；取MUB校准液用无菌去离子水依次稀释为1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液；在黑色酶标板上，依次加入100μL浓度为0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB荧光标准物质溶液，4次重复，再分别加入100μL pH10-11的1M Tris终止液后，采用多功能酶标仪进行荧光检测。