[发明专利]一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，属于酶活检测技术领域。本发明提供的检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法包括：称取过筛的凋落物碎屑到离心过滤管中，加入培养缓冲液低温孵育，高速离心后将滤液混合并调节至一定体积；将待测酶液和灭活酶液分别加入黑色酶标板孔内，再加入荧光共轭纤维素二糖苷工作液，在避光条件下震荡孵育后，向各酶标孔加入Tris终止液；采用多功能酶标仪进行荧光检测；计算外切葡聚糖酶活性。本发明的优点为：优化了反应体系，反应酶液需求少，减少了其它酶活和人为操作干扰，灵敏度高，结果可靠，将反应体系置于酶标板内，避光震荡培养后添加终止液即可上机操作，批量获得结果数据，效率高。

技术领域

本发明属于酶活检测技术领域，更具体地说，涉及一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法。

背景技术

凋落物分解是森林土壤物质转化的基础，是植物和微生物养分的主要来源，在维持森林生态系统碳及养分循环中起重要作用。微生物是森林凋落物分解的主要贡献者，在凋落物降解的过程中，凋落物上定殖的微生物会分泌各种胞外酶，改变凋落物的组成结构，从而促进凋落物的降解。作为参与凋落物分解最为重要的生物活性物质，酶活性涉及各种生物化学过程，与凋落物的分解直接相关，在很大程度上反映了土壤C、N、P等养分循环状况，且因凋落物类型及环境条件的不同而异。研究凋落物中各种酶类活性在凋落物分解过程的活性动态，对了解森林凋落物分的微观生态过程具有重要意义。

外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)，即C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶，可以吸附作用于纤维素分子的结晶区，从纤维素线状分子的末端使其结构破坏，从而有利于内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶发挥降解作用。因此外切葡聚糖酶活性对于森林凋落物和土壤有机质的降解以及养分循环，乃至维持森林生态系统的生物化学循环和能量流动以及提升土壤肥力具有重要意义。由于外切葡聚糖酶活性对凋落物数量和组成以及土壤理化性质等环境因素的变化敏感，且是土壤微生物作用于土壤物质循环的直接媒介，可作为反映土壤微生物群落活性的指标之一。因此，提供一种操作迅速、灵敏度高、批量读取数据和结果精准的外切葡聚糖酶活性检测方法具有很重要的意义。

我国凋落物外切葡聚糖酶活性的测定是在土壤酶学活性测定方法基础上的改进，但对森林凋落物外切葡聚糖酶活性测定的研究存在着技术更新换代慢、方法粗放繁琐以及测定结果易受其他纤维素酶干扰等诸多问题。其中以微晶纤维素作底物的比色法，酶解产物用DNS试剂显色后比色测定，但反应本身是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用结果，并不能真实反映外切葡聚糖酶活力，且DNS显色试剂的配制时间、沸水浴中反应的激烈程度等进一步降低了结果的可靠性；以对-硝基酚纤维二糖苷为底物进行酶解的比色法虽操作简单，但需添加其它酶的抑制剂，且操作时间过长，需要酶液过多，增加应用中的不便。并且由于森林中原有凋落物构成复杂：可能有的表层凋落物没有或者很少有降解微生物定殖，微生物分泌胞外外切葡聚糖酶少，也有可能有的凋落物已经处于降解末期。这种复杂情况不利于多种样本之间进行比较研究酶活性及其变化差异，因此凋落物外切葡聚糖酶活性的检测比土壤酶活测定在前期也需要更多人工干预，使之标准化，以利于凋落物降解过程的研究。

综上，目前需要提供一种新的、标准化、快速便捷的凋落物外切葡聚糖酶活性的检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测凋落物外切葡聚糖酶活性的方法，包括如下步骤：

1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管中离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；

2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热，使酶灭活，成为灭活酶液；

3)配制梯度浓度的4-甲基伞形酮(MUB)荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；