[发明专利]一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系，其为SHERLOCK反应体系，包括用于扩增目的核酸片段的RPA引物对和/或crRNA，所述crRNA用于结合扩增后的目的核酸片段转录的ssRNA，所述引物对包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的引物，所述crRNA由crDNA合成，所述crDNA的序列如SEQ ID NO.3所示；还包括Cas13a和荧光标记探针等，Cas13a与已结合ssRNA的crRNA结合从而使其具有RNA酶活性，具有RNA酶活性的Cas13a切割荧光标记探针而产生荧光，产生的荧光可进行实时检测。本发明还涉及包括上述反应体系的试剂盒及上述RPA引物对和/或crRNA的相关应用。利用本发明的试剂盒及检测方法进行非洲猪瘟病毒核酸的检测，可以实现37℃条件下恒温检测，反应时间短、检测速度快，且灵敏度和特异性高。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸的反应体系、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟是一种高度传染性、爆发性的导致家猪和野猪出血症状的一种高度致死性传染病。非洲猪瘟传播迅速，导致严重的社会经济危机，是动物和动物产品的国际贸易中重要监控疫病。非洲猪瘟的病原是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属成员，非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的双链DNA病毒，该病毒在野外主要依靠钝缘软蜱进行传播，而在家养环境中不依赖钝缘软蜱也能传播。仅仅通过对B646L基因的C末端区域进行测序就已经鉴定出20多个ASFV的基因型。1921年肯尼亚首次报告非洲猪瘟以后，该病仅限于撒哈拉以南的非洲地区。2007年后迅速扩散到俄罗斯西部和南部广大地区并在这些地区的家猪和野猪之间互相感染而失去控制。该病毒随后传播到东欧和中欧。2018年8月，中国辽宁省报告了一次新的ASFV疫情，仅2019年全国就报告多达63起。

国内外目前常用的快速诊断方法包括基于抗原抗体反应建立的血清学诊断方法、基于核酸扩增建立的病原检测技术，目前快速、高通量的液相芯片技术和微流控芯片技术也是建立在这两种技术的基础上。但是这些检测方法都有一定的局限性。

基于抗原抗体反应的快速诊断方法的开发周期长、成本高；鉴于高特异性、高灵敏度的PCR、RT-PCR等技术现场条件难以开展；RPA技术尽管非常方便的实现现场诊断，但RPA主要具有几个方面的局限性：RPA不能做到实时定量检测；RPA对引物的设计非常敏感，需要将引物设计的更长且需要从多对引物中筛选高灵敏度的引物。此外，液相芯片技术仪器和试剂昂贵，微流控芯片检测灵敏度有待优化、检测结果不稳定，上述因素影响了这些技术在检疫工作中的推广使用。

规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)在基因编辑过程中发挥了强大的生命力，正在生物医学研究领域引起一场巨变。其中，科学家掌握了对一种蛋白-Cas9的操作技术，并先后利用该技术对多种细胞的DNA进行了编辑。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统，迅速成为生命科学最热门的技术。不像其他基因编辑手段，它使用起来廉价、迅速且简单，并因此席卷全球实验室。最近科学家发现CRISPR在核酸检测方面同样表现出了强大的生命力。