[发明专利]新型冠状病毒全基因组高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒

权利要求书

1.新型冠状病毒全基因组高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、提取病毒样本RNA，反转录成单链cDNA或双链cDNA；

B、根据已公布的新型冠状病毒COVID-19基因组序列，进行叠瓦式全覆盖式引物设计，分别设计得到锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组1和锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组2，以单链cDNA或双链cDNA为模板，分别利用引物组1、引物组2进行第一轮PCR反应，将扩增产物按照等摩尔量混合以覆盖病毒全基因组；

C、以步骤B中混合后的扩增产物为模板，利用标签化Illumina文库扩增引物进行第二轮PCR反应，扩增产物经纯化，得到高通量测序文库；

其中，步骤B中锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组1和锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组2的设计方法包括：

B1、根据新型冠状病毒COVID-19基因组序列，分别设计多重特异性扩增引物组I和多重特异性扩增引物组II，引物组I包括正向引物F池和反向引物R池，引物组II包括正向引物F′池和反向引物R′池，每对正向引物和反向引物对应于一个扩增子；在引物组I的相邻两个扩增子序列内，分别设计引物组II的正向引物和反向引物，在引物组II的相邻两个扩增子序列内，分别设计引物组I的正向引物和反向引物，周而复始，直到引物组I对应的扩增子和引物组II对应的扩增子以叠瓦式覆盖病毒全基因组；

B2、将Illumina部分接头序列①按照5′-3′方向添加到各正向引物的5′端，将Illumina部分接头序列②按照5′-3′方向添加到各反向引物的5′端；将带有Illumina部分接头序列①的正向引物F池和带有Illumina部分接头序列②的反向引物R池作为锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组1；将带有Illumina部分接头序列①的正向引物F′池和带有Illumina部分接头序列②的反向引物R′池作为锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组2；

其中，Illumina部分接头序列①的序列如下：5′-I7标签化引物3′末端序列-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′；

Illumina部分接头序列②的序列如下：5′-I5标签化引物3′末端序列-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′；

且I7标签化引物3′末端序列的大小为9～15bp，I5标签化引物3′末端序列的大小为8～14bp，以保证I7标签化引物和I5标签化引物可以特异性退火至扩增子上的3′末端结合位置；

步骤B中锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组1和锚定部分Illumina接头序列的多重扩增引物组2共包含250对引物，其中正向引物为COV-1-F～COV-250-F，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-252所示，反向引物为COV-1-R～COV-250-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:253-502所示，其中，COV-1-F和COV-1-R为一对引物，COV-2-F和COV-2-R为一对引物，以此类推。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中各引物对之间的Tm阈值差为±2℃；和/或

扩增子大小为200-300bp；和/或

引物设计时去除可能导致引物间或引物内部形成二聚体和茎环结构的引物对；和/或

在同一多重特异性扩增引物组中，使基因组上游扩增子的反向引物序列5’端位于下游扩增子的正向引物序列5’端的上游。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中将RNA反转录成单链cDNA的方法选自如下a或b：

a、利用6-10bp随机引物引导单链cDNA合成；

b、利用来自反向引物R池和反向引物R′池中的若干条引物混合成一个特异性反转录引物组引导单链cDNA合成，且这些反向引物沿病毒基因组3′-5′方向均匀分布，引物间相隔800-1000bp；

步骤A中将RNA反转录成双链cDNA的方法包括：

i、利用6-10bp随机引物引导单链cDNA合成；

ii、在dNTPs存在的条件下，利用RNA酶H使RNA-cDNA杂合双链产生缺口；

iii、以缺口处的产生的小片段RNA为引物，利用RNA依赖性的DNA聚合酶合成双链cDNA。