[发明专利]一种鸭圆环病毒组织灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一株鸭圆环病毒，该毒株的保藏编号为CGMCC No.19296。

2.一种鸭圆环病毒组织灭活疫苗，其特征在于：其有效组分为：

疫苗质量比为1:3-6的含鸭圆环病毒肝脏组织和无菌水的研磨液，经研磨、反复冻融、过滤后制作而成，与松花粉多糖复配后再与白油佐剂乳化而成；松花粉多糖的终浓度为10-30mg/mL；

所采用的鸭圆环病毒的保藏编号为CGMCC No.19296。

3.根据权利要求2所述的鸭圆环病毒组织灭活疫苗，其特征在于：

所述鸭圆环病毒抗原是通过将病毒腹腔注射感染1日龄雏鸭，此后每隔7天用静脉注射方式加强感染一次，每次感染病毒量不低于1×10⁷copies，每次接种同时注射250mg/kg的环磷酰胺诱导免疫抑制加强病毒复制，于25日龄采集感染鸭整个肝脏组织，通过荧光定量PCR技术检测肝脏中的病毒含量≥1×10⁸copies/g，即可作为原始抗原组织；

组织经过配比、匀浆、冻融、离心、过滤步骤制备疫苗用抗原液；同时，抗原液中添加5-40mg/mL浓度松花粉多糖作为免疫增强剂；

抗原液经过甲醛灭活，与白油佐剂乳化，制作而成疫苗。

4.根据权利要求2所述的鸭圆环病毒组织灭活疫苗，其特征在于：

组织灭活疫苗鸭圆环病毒组织抗原和无菌水的质量比为1:4-6。

5.根据权利要求2或4所述的鸭圆环病毒组织灭活疫苗，其特征在于：所述的组织灭活疫苗鸭圆环病毒组织抗原和无菌水的质量比为1:5，松花粉多糖的浓度为20mg/mL。

6.权利要求2所述的鸭圆环病毒组织灭活疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

选用1日龄健康樱桃谷雏鸭腹腔注射接种纯化的鸭圆环病毒毒种，每隔7天静脉注射补接一次，每次感染病毒量不低于1×10⁷copies，每次感染时同时注射250mg/kg剂量的环磷酰胺人工诱导免疫抑制以利于病毒复制，至25日龄时，采集鸭肝脏，检测鸭圆环病毒的含量≥1×10⁸copies/g，备用；

将质量比为1:5的鸭肝脏与无菌水混合，用组织细胞破壁机充分研磨破壁匀浆，组织匀浆后反复冻融3次，然后用5000-8000rpm转离心机离心20-30min，收集上清并用纱布过滤，加入5-40mg/mL浓度松花粉多糖，加入终浓度为体积分数千分之二的甲醛于37℃灭活48h，作为最终的抗原液。质量比为1：1的抗原液与商品化的白油佐剂充分乳化，制作而成鸭圆环病毒组织灭活疫苗；

其中所述的机械乳化法采用设备为胶体磨、均质机或匀浆机完成，以混合物的特性达到上述标准为宜。

7.利用权利要求2所述的鸭圆环病毒组织灭活疫苗制作卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)用制备的灭活疫苗分4次对开产前1个月左右的蛋鸡进行免疫,每次免疫间隔2周；前期4次免疫完后，后续每隔1-2个月免疫一次，每次免疫剂量为1.0-2.0mL/只；

(2)第4次免疫后两周开始收集免疫蛋，持续收蛋过程中保持每隔1-2个月免疫一次；用蛋黄分离器将将卵黄与蛋清分离，卵黄与预热到30℃-37℃纯净水按体积3-5:1混合稀释蛋黄液,搅拌均匀后得到卵黄稀释液,于30℃-37℃条件下预温1h；

(3)向蛋黄稀释液中加入质量分数为3-4％的PEG6000，与蛋黄混合后充分搅拌均匀，静置4-6h，充分反应；

(4)将反应后的上清液抽出，用100-200目滤网粗滤，其中先用100目，再用200目过滤；

(5)将过滤的上清液装入无菌桶进行二次沉淀，时间为24-48h；

(6)将二次沉淀的上清液抽出，用200目滤网先粗滤一遍，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；除菌后的上清中加入体积分数为千分之一的甲醛灭活未知病毒并作为防腐剂，即精制卵黄抗体，且经检测抗鸭圆环病毒和腺病毒抗体的琼扩试验效价应最低不低于1:64。

(7)在无菌条件下将滤液分装于无菌疫苗瓶中,盖好胶塞,轧铝盖,贴上标签,保存备用,保存温度为4-8℃。

8.根据权利要求7所述卵黄抗体的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中前期4次免疫完后，后续每隔1.5个月免疫一次；

步骤(2)中的稀释体积比为3.5:1，温度为35℃；

步骤(3)中的PEG6000添加量为3.5％；其中PEG6000可预先用少量温水溶解。