[发明专利]基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测方法，其特征在于，包括步骤：

1)界面RPA反应：向含RPA组分的冻干粉中加入反应缓冲液、RPA上游引物、RPA下游引物、双蒸水、醋酸镁、DNA模板，进行混匀并离心，取混合液滴加于多通道传感电极阵列表面，37℃孵育10-50min，用洗涤液冲洗电极；所述多通道传感电极阵列的每个通道包括工作电极、对电极以及参比电极，所述工作电极表面固定有RPA探针，所述RPA探针通过与所述工作电极的表面的键合作用固定于所述工作电极的表面，并用牛血清白蛋白及酪蛋白封闭了所述工作电极的表面的非特异结合位点；所述RPA上游引物、RPA下游引物的其中之一为一端生物素化的引物，在RPA扩增过程中产生一端生物素化的扩增产物，与所述RPA探针互补结合并进行界面上RPA扩增反应从而在电极界面形成一端标记生物素的双链DNA；

2)电流信号采集：滴加亲和素-HRP酶偶联物于所述多通道传感电极阵列表面形成复合物，室温孵育5-15min，洗涤液冲洗后，滴加底物溶液到所述多通道传感电极阵列，所述底物溶液包含HRP催化底物，用多通道电化学仪进行电流时间曲线扫描以检测HRP催化底物的还原电流，记录稳态电流值为检测信号；

3)结果判定：以阴性对照电流平均值+3SD为阈值，样本平均电流超过阈值判定为阳性样本，低于阈值判定为阴性样本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多通道传感电极阵列为碳电极阵列，所述工作电极及对电极为碳电极，所述参比电极为银电极，所述工作电极表面固定有氨基修饰的RPA探针，所述氨基修饰的RPA探针通过与所述工作电极表面的羧基酰胺键合作用固定于所述工作电极表面。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多通道传感电极阵列为金电极阵列，所述工作电极、对电极及参比电极均为为金电极，所述工作电极表面固定有巯基修饰的RPA探针，所述巯基修饰的RPA探针通过与所述工作电极金硫键合作用固定于所述工作电极表面。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含RPA组分的冻干粉包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液为含有双氧水的TMB溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液为PBS。

8.一种基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测试剂盒，其特征在于，包括：多通道传感电极阵列，所述多通道传感电极阵列的每个通道包括工作电极、对电极以及参比电极，所述工作电极的表面固定有RPA探针，所述RPA探针通过与所述工作电极的表面的键合作用固定于所述工作电极的表面，并用牛血清白蛋白及酪蛋白封闭了所述工作电极的表面的非特异结合位点；RPA引物，所述RPA引物包括上游引物和下游引物；含RPA组分的冻干粉；醋酸镁；反应缓冲液；亲和素-HRP酶偶联物；底物溶液以及洗涤液。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照与阳性对照。