[发明专利]基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测方法，包括步骤：界面RPA反应、2)电流信号采集、3)结果判定；在界面RPA反应过程中，一端生物素化的扩增产物，与固定于多通道传感电极阵列的工作电极的RPA探针互补结合进行界面RPA扩增在电极界面形成一端标记生物素的双链DNA，再与亲和素‑HRP酶偶联物形成复合物，并通过检测HRP催化底物的还原电流实现信号采集；本发明还公开一种基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于界面RPA的电化学核酸传感检测方法与试剂盒。

背景技术

我国寄生虫病诊断大多采用免疫学辅助诊断结合病原学确诊技术，然而在当前以疟疾、血吸虫为代表的寄生虫等疫情呈低流行态势的情况下，免疫学及病原学方法存在的弊端已难以满足疫情监测需求。主要表现在：传统的病原学诊断方法对低感染度患者的检测敏感性较低，漏检率高。血清学抗体检测方法敏感性虽高，操作简便，但易出现假阳性，且抗体水平检测难以区分现症感染和既往感染。

随着分子生物学技术的发展，检测核酸序列的分子诊断方法因其敏感性高、特异性强等优势越来越受到关注，有望为传染病疫情的精准监测提供有效的技术手段。近年来，已有多种核酸检测方法的相关报道，包括PCR、巢式PCR、实时定量PCR、数字PCR、环介导等温扩增重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)等，这些方法大多基于PCR，少部分基于等温扩增技术。RPA技术是近年来新兴的一种核酸等温扩增技术，25～43℃恒温下，5～20min可将核酸扩增至可检测水平,操作简单、快速，且可结合多种方法读取结果，尤其适合基层应用。与传统PCR相比，该方法无需高昂仪器设备，依靠水浴锅，甚至是在室温下即可完成反应，被认为是一种最有可能替代PCR的等温扩增技术，已被广泛应用于各种包括寄生虫在内的传染病的检测。然而目前报道的基于RPA的核酸检测方法的敏感性仍不够理想，需探索更加灵敏的检测技术与RPA结合，从而提高核酸检测敏感性及特异性，并通过简化设备及操作，提高检测时效性及重复性，使之更适于现场应用。

发明内容

本发明的目的是联合RPA技术及电化学生物传感技术，提供一种基于界面RPA的电化学核酸传感检测试剂盒及其检测方法，以解决现有基于RPA的核酸检测方法的敏感性及特异性不理想的技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于界面RPA扩增的电化学核酸传感检测方法，其主要原理为：在RPA反应过程中，先形成一端生物素化的扩增产物，之后与固定于电极界面的探针互补结合，进行电极界面上的RPA反应，在电极界面形成一端标记生物素的双链DNA，再与亲和素-HRP酶偶联物形成复合物，并通过检测HRP催化底物的还原电流实现信号采集。

其包括步骤：

1)界面RPA反应：向含RPA组分的冻干粉中加入反应缓冲液、RPA上游引物、RPA下游引物、双蒸水、醋酸镁、DNA模板，进行混匀并离心，取混合液滴加于多通道传感电极阵列表面，37℃孵育10-50min，用洗涤液冲洗电极；所述多通道传感电极阵列的每个通道包括工作电极、对电极以及参比电极，所述工作电极表面固定有RPA探针，所述RPA探针通过与所述工作电极的表面的键合作用固定于所述工作电极的表面，并用牛血清白蛋白及酪蛋白封闭了所述工作电极的表面的非特异结合位点，以避免后续反应中无关DNA及蛋白的非特异吸附；所述RPA上游引物、RPA下游引物的其中之一为一端生物素化的引物，在RPA扩增过程中产生一端生物素化的扩增产物，与所述RPA探针互补结合并进行界面上RPA扩增反应从而在电极界面形成大量一端标记生物素的双链DNA；醋酸镁具有启动RPA反应的作用；反应缓冲液，其作用是溶解RPA冻干组分，并在RPA反应中提供稳定的缓冲体系；