[发明专利]一种CSF1-Albumin重组蛋白及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 202010410381.6 | 申请日： | 2020-05-15 |
| 公开（公告）号： | CN111548421B | 公开（公告）日： | 2023-09-19 |
| 发明（设计）人： | 盛剑鹏 | 申请（专利权）人： | 乾元康安（苏州）生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C07K19/00 | 分类号： | C07K19/00;C12N15/62;C12N15/66;C12N15/85;A61K38/19;A61K47/64;A61P17/00;A61P21/00;A61P25/00 |
| 代理公司： | 苏州市方略专利代理事务所(普通合伙) 32267 | 代理人： | 石磊 |
| 地址： | 215400 江苏省苏州*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 csf1 albumin 重组 蛋白 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种CSF1-Albumin重组蛋白在制备用于修复皮肤损伤的药物中的应用，其特征在于，
所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1) 培养细胞；
(2) 将获得的CSF1-Albumin重组蛋白的生产载体转染至上述细胞；
(3) 培养转染后的细胞并收取CSF1-Albumin重组蛋白；
(4) 纯化上述CSF1-Albumin重组蛋白；
(5) 测试上述CSF1-Albumin重组蛋白；
所述步骤（2）中生产载体的构建方法，包含以下步骤：
a以CSF1的cDNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ IDNO.2所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段CSF1；
b以Albumin的cDNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ IDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段Albumin；
c以上一步骤得到的基因片段CSF1与Albumin为模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行Overlap PCR得到序列如SEQ ID NO.7所示的融合基因片段CSF1-Albumin；
d将融合基因片段CSF1-Albumin利用酶切克隆至克隆载体，得到CSF1-Albumin重组蛋白的生产载体；
所述步骤d中的酶切的位点为MfeI和EcoRI，所述克隆载体为pMyc-IRES-GFP，所述得到的CSF1-Albumin重组蛋白的生产载体为pMyc-CSF1-Albumin-IRES-GFP，其序列如SEQ IDNO.8所示；
所述步骤（3）中的细胞为FreeStyle 293-F；
所述步骤（4）包括：使用Ni-NTA Superflow Resin纯化CSF1-Albumin重组蛋白，并使用NanoDrop测定CSF1-Albumin重组蛋白浓度，并调整至2mg/mL；
所述步骤（5）包括将表达CSF1受体CSF1R的THP-1细胞与CSF1-Albumin共孵育，并用流式细胞仪检测CSF1-Albumin重组蛋白结合情况；
所述应用包括：在6周大C57小鼠建立皮肤组织损伤模型后，注射CSF1-Albumin重组蛋白200ug每次，一周三次；两周后通过HE染色检测皮肤组织复原情况。
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