[发明专利]一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及使用方法、应用

说明书

本发明公开了一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及其使用方法、应用。该试剂盒包括检测或测量受试样品DNA中一种或多种特定基因的甲基化状态或水平的特异性引物和探针，所述特定基因为SEPT9、NDRG4和ACTB。本发明试剂盒能够显著提高早期结直肠癌的阳性检出率和特异性(真实阴性率)，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子。

技术领域

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于结直肠癌检测的DNA甲基化试剂盒及其使用方法、应用，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个目标基因靶点的甲基化状态来用于结直肠癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)是全世界第三大常见癌症，每年有600,000人死亡。对于CRC，早期识别和早期干预是降低死亡率的最佳方法。目前的筛查方法是结肠镜检查和大便隐血和免疫组织化学检测(gFOBT/FIT)。由于结肠镜检查的不适以及对肠道制品的厌恶，这些筛查方法并未充分使用。因此，使用可靠的非侵入性血液基础检测来评估CRC风险对于早期发现CRC可能是有价值的。

液体活检是用检测分子生物标志物来替代传统组织活检的非侵入性方法，其用于分析的生物样品(如DNA)可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样本中获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：

1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；

2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；

3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；

4.便于早期发现癌症；

5.能用于监测肿瘤动态(治疗前、治疗间和治疗后)；

6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。

坏死或凋亡的细胞释放到血液中的DNA，被称为循环游离DNA(circulating freeDNA，cfDNA)，然而在肿瘤患者的血液中，一部分cfDNA来自死亡的肿瘤细胞，这部分DNA就被定义为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA多为大约134-144bp的DNA片段，并携带一定的肿瘤特征(包括异常甲基化、突变、缺少、插入、拷贝数等)。较早期的癌症(意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)，释放较少的游离循环肿瘤ctDNA，而其浓度更小于游离cfDNA；当肿瘤负荷增加时，患者的ctDNA水平会升高。迄今为止，ctDNA是获得癌症患者血液中分子肿瘤相关改变的诊断、预后、以及预测信息的最佳材料。

DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。在结直肠癌中，SEPT9、NDRG4、MLH1和其它基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接续鸟苷(G))的高甲基化已被认为是癌症的生物标记之一。因此，对这些基因中的一种或多种的甲基化状态进行分析可用于诊断结直肠癌的状态。

ctDNA的甲基化分析可以为癌症诊断提供了一个可行的选择，但临床上使用ctDNA辅助癌症诊断和疗法选择的主要挑战，仍在于如何开发高灵敏度的检测方法以便在高cfDNA背景水平中区分微弱的ctDNA信号，特别是对于ctDNA浓度可能至pg/mL程度的早期诊断，对检测方法的灵敏度和选择性要求更高。然而，目前的检测试剂盒由于受到DNA提取方法不佳、亚硫酸氢盐处理量差、用于检测甲基化DNA的引物或者探针设计不佳等定量PCR方法的限制，并不能很好地利用ctDNA甲基化基因进行结直肠癌的早期筛查和辅助诊断。