[发明专利]一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因，其特征在于，所述NS-HAmut-NS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HA-NS1-128mut-HA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种重组H9N2亚型禽流感病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因分别构建到pHW2000质粒载体上，得到pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA；

（2）以H9N2亚型禽流感病毒TX株为亲本毒株，将步骤（1）中所述pHW-NS-HAmut-NS和pHW-HA-NS1-128mut-HA与所述亲本毒株的其余6片段共转染真核细胞，得到重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)；

所述亲本毒株的其余6片段对应的Genebank序列号如下：PB2： JN653572；PB1：JN653588；PA：JN653604；NP：JN653636；NA：JN653652；M：JN653668；经所述6片段克隆至pHW2000质粒载体，得到pHW291-PB2、pHW292-PB1、pHW293-PA、pHW295-NP、pHW296-NA和pHW297-M片段；

所述共转染的方法包括脂质体共转染法；

所述真核细胞为MDCK和293T细胞；所述MDCK和293T细胞的个数比为1:3，所述MDCK和293T细胞的融合度为60~80%；

所述共转染后，还包括细胞培养；所述细胞培养的条件在不含抗生素和血清的DMEM中37℃二氧化碳培养箱培养8~10 h，换液为含有终浓度为2 μg/ml TPCK胰酶的无抗无血DMEM，37℃培养60h，-70℃冻融后收集细胞上清液。

3.权利要求2所述的构建方法构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)。

4.一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2减毒活疫苗，其特征在于，由权利要求3所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)制备得到。

5.权利要求3所述重组H9N2亚型禽流感病毒rTX-NS1-128(mut)在H9N2减毒活疫苗中的应用。