[发明专利]一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用，属于疫苗技术领域。一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒，包括重组NS‑HAmut‑NS和HA‑NS1‑128mut‑HA基因。所述重组NS‑HAmut‑NS和HA‑NS1‑128mut‑HA基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用本发明所述基因构建得到的重组H9N2亚型禽流感病毒能有效避免HA和NS片段与野生毒株发生重配，且具有减毒特性和良好的攻毒保护效力。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种互换HA和NS1缺失基因包装信号的H9N2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用。

背景技术

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenzavirus,AIV)可感染多种家禽和野禽。虽然H9N2亚型AIV毒株对家禽的致病性较低，但给养禽业造成的经济损失巨大，主要造成呼吸道症状、免疫抑制和产蛋量下降。H9N2 AIV具有结合哺乳动物受体的特性，有研究证实其可通过气溶胶在雪貂之间进行传播。此外，H9N2 AIV可以提供部分或全部内部基因给H5N1、H7N9、H10N8和H5N6亚型的AIV发生重组，产生重配病毒，如2015～2016年，我国东部的活禽市场分离到含 H9N2亚型AIV内部基因盒的H5N6亚型AIV；2013年分离到6个内部基因片段全部来源于H9N2 AIV的新型H7N9流感病毒，因此，防控H9N2禽流感同样具有重要公共卫生学意义。

我国自1998年开始使用H9N2亚型禽流感灭活疫苗(Li CJ,et al. 2005)，对控制H9N2禽流感的流行起到了关键作用。然而，不同年代的H9N2 AIV存在毒力差异和抗原漂移，且灭活疫苗存在只能诱导体液免疫、佐剂价格高、有效抗体产生时间长，免疫鸡群虽能产生高水平抗体，但不能有效抑制鸡群排毒等缺点，因此有必要开发广谱的新型疫苗。

与灭活疫苗相比，活疫苗免疫效果更能有效产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，降低临床上H9N2 AIV的感染率和排毒率，且可以采用比较方便的接种方式如滴鼻点眼、饮水、喷雾等，降低免疫的人工成本。活疫苗种类繁多，可以通过基因修饰的方法设计活疫苗，比如通过基因缺失和基因重排反向遗传拯救病毒的方式或通过鸡胚连续低温传代获得冷适应毒株等方式获得减毒的活疫苗。减毒活疫苗在预防人类季节性流感方面已经取得了初步成功，并已成功上市使用。人类流感减毒疫苗的成功案例，给家禽疫苗的研究提供了发展方向。目前已研究出了一系列针对H9N2亚型AIV的减毒活疫苗候选株，如通过梯度降温培育的冷适应减毒活疫苗株。这些减毒活疫苗可以更好的诱导粘膜免疫和细胞免疫、较小的剂量就可以在短时间内诱导产生有效的免疫应答。

近年来，本研究团队构建获得了一株NS1基因截短的H9N2减毒活疫苗株(公开号CN104830811，公开日2015.8.12)，经动物实验证明其在SPF鸡群及蛋鸡中均能对鸡群提供良好的保护，且不会排毒，是一株理想的减毒活疫苗候选株。避免流感病毒减毒活疫苗应用后重组的研究也逐渐成为减毒活疫苗的研究重点。但减毒活疫苗也存在一定的缺陷，例如疫苗毒株与环境中野生型AIV交换内部基因片段，造成新的流行毒株的出现，造成减毒活疫苗的毒力返强。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因及其构建的重组病毒，有效防止H9N2亚型AIV减毒活疫苗的HA和NS片段发生重配，保证疫苗的安全性。

本发明提供了一种互换HA和NS缺失基因包装信号的H9N2重组NS-HAmut-NS和HA-NS1-128mut-HA基因，所述NS-HAmut-NS 的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HA-NS1-128mut-HA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种重组H9N2亚型禽流感病毒的构建方法，包括以下步骤：