[发明专利]一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用，新冠病毒核酸检测试剂盒包括分别根据新冠病毒核酸ORF1ab基因、N基因、E基因序列合成引物和探针、根据ACE2基因序列合成一对特异的内对照引物和TaqMan探针ACE2TM、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、PCR缓冲液、超纯水和待测RNA模板，一步法将缓冲反应体系进行逆转录反应合成模板cDNA，再进行反复热循环，获得PCR产物并降解其探针释放荧光素A，ACE2基因则降解其探针释放荧光素B。内内引物引导的PCR产物以超过2倍的速度增加，可以从根本上解决特异性扩增的效率，并能够鉴别出由于取材误差导致的假阴性结果，从而提高检测结果的准确性。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术中的RNA体外扩增技术领域，尤其涉及一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用。

背景技术

现有的新冠病毒核酸体外扩增检测技术及其试剂盒基本上都是基于RT-QPCR技术平台，该技术首先将RNA逆转录合成模板cDNA，再将耐热DNA聚合酶、特异引物探针、dNTPs底物、模板cDNA、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温、低温、中温的热循环，以使模板DNA变性、引物与模板复性、引物延伸反复进行热循环和荧光检测，而达到靶DNA片段在体外呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)。临床实践表明，这种方法出现了较多的假阴性结果，分析原因可能存在以下几个方面：

1、常规的荧光定量PCR灵敏度局限，由于模板数量较少，需要更多的循环数才能达到检测，而由于经常遇到引物二聚体和其它非特异性扩增的产生，而一旦产生非特异性模板，由于其与特异性扩增的效率相当，并竟争底物与酶，使特异性扩增受到抑制，特异性扩增效率降低。尤其在扩增粗提的临床标本时，常导致临床基因诊断的假阳性和假阴性结果的产生。

2、用于提高PCR扩增特异性的方法已有热启动法、固体石蜡膜法、抗体-酶法、双链引物法等。这些方法虽然都能在一定程度上提高PCR扩增的特异性与其扩增效率，但与常规PCR相比都只是略有改进，而没有本质的变化，特异性扩增效率都不会超过2n倍。

普通巢式PCR(nest PCR)是一种特异性很高的PCR，其本质是在一段待扩增的靶序列中设计外侧、内侧两对引物。先用外侧引物进行扩增，完成后再取扩增产物作模板用内侧引物扩增，即要进行两次连续的PCR反应，这种方法操作较复杂，费时较长，而其每一次的PCR中，扩增的效率也不会超过2n倍，同时由于第二次扩增要用外侧引物扩增的PCR产物做模板，很容易造成PCR产物污染，导致扩增的假阳性。

另外，由于新冠病毒主要干扰深部肺泡上皮细胞，在病毒滴度较低时，因为取材技术和方法不规范，没能够取到病毒或含有病毒的细胞，也可以产生假阴性结果，从而降低了检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新冠病毒核酸检测试剂盒、制备方法及应用，采用了一种操作简单、特异性高、特异性扩增效率超过2n倍的DNA体外扩增技术即巢式共扩增聚合酶链反应(nest coamplification polymerase chain reaction，NCA-PCR)和增加ACE2内参照基因检测的多重PCR扩增技术，可以从根本上解决特异性扩增的效率，并能够鉴别出由于取材误差导致的假阴性结果，从而提高了检测结果的准确性。