[发明专利]一种食用菌菌种新保护剂配置方法及降温程序

权利要求书

1.一种食用菌菌种新保护剂配置方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将保藏用琼脂培养基倒人无菌培养皿内制成平板，然后在平板中心接种食用菌菌丝，适温条件下培养至菌丝发满平板；

(2)沿菌落边缘将琼脂菌丝块分成约2mm³的小块，转接100～150块到装有20ml的保藏用液体培养基的烧瓶中，所述保藏用液体培养基包括：麦芽糖10g/L，KH₂PO₄ 1g/L，pH自然；

(3)以每3分钟105μl的频率向该烧瓶中添加无菌4M山梨醇，共10次30分钟，每次添加后摇匀，黑暗条件下，在转速为60转/分的旋转摇床上室温孵育24小时；

(4)以每3分钟117μl的频率向该烧瓶中添加无菌4M山梨醇，共10次30分钟，每次添加后摇匀，黑暗条件下，在转速为60转/分的旋转摇床上室温孵育24小时；

(5)将孵育结束的烧瓶置于冰浴中，以每3分钟添加117μl的频率向该烧瓶中添加二甲亚砜，共10次30分钟，每次加入后都要摇匀烧瓶；添加结束后，将烧瓶静置30分钟；

(6)向冰上预冷的保藏管中分注1-1.5ml上述菌种及保藏液，瓶盖旋紧；

(7)采用降温程序对保藏管进行降温，降温后转置于液氮容器中。

2.根据权利要求1所述的一种食用菌菌种新保护剂配置方法，其特征在于，所述保藏用琼脂培养基包括：

麦芽浸粉：30.0g/L，大豆胨：3.0g/L，琼脂：20.0g/L，pH5.6±0.2(25℃)。

3.根据权利要求2所述的一种食用菌菌种新保护剂配置方法，其特征在于，所述保藏用琼脂培养基和所述保藏用液体培养基使用前，需在1×10⁵Pa条件下灭菌30min。

4.用于权利要求1～3任一项所述的食用菌菌种新保护剂配置方法的降温程序，其特征在于，包括：

－1℃，持续10分钟；

以0.3℃/min降至-16℃，并保持15分钟；

然后以0.3℃/min降至－35.5℃；

最后以25℃/min降至－50℃。

5.一种食用菌复苏培养方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将保藏管取出，置于装有45℃无菌水的容器中3-4分钟；

(2)转移到4℃无菌水容器中解冻；

(3)将保藏管浸入4℃、70％乙醇中进行消毒；

(4)消毒后取出，在超净台上风干；

(5)将每个保藏管内所有琼脂块倒在培养皿中3层直径为30–40mm的无菌滤纸上，放置10分钟；

(6)将琼脂块转接培养。