[发明专利]一种食用菌菌种新保护剂配置方法及降温程序

说明书

本发明涉及一种食用菌菌种新保护剂配置方法，包括以下步骤：在保藏用琼脂培养基的平板中心接种食用菌菌丝；将琼脂菌丝块转接到装有20ml的保藏用液体培养基的烧瓶中；前后分两步骤分别以每3分钟105μl的频率和每3分钟117μl的频率向该烧瓶中添加4M山梨醇；将孵育结束的烧瓶置于冰浴中，以每3分钟添加117μl的频率向该烧瓶中添加二甲亚砜；向冰上预冷的保藏管中分注1‑1.5ml上述菌种保藏液；采用降温程序对保藏管进行降温。本发明还提供了一种降温程序以及一种食用菌复苏培养方法。本发明的一种新保护剂配置方法，解决了食用菌菌种在低温条件下不易存活的问题，使保藏的菌种保持生物活力，可长期保藏。

技术领域

本发明属于食用菌菌种保藏技术领域，具体涉及一种液氮保种用食用菌菌种新保护剂配置方法及降温程序。

背景技术

菌种是食用菌产业最重要的生产资料。目前，随着我国食用菌工厂化生产规模的不断扩大，对高质量菌种的需求也越来越强烈。菌种在应用过程中必然发生对生产不利的变化，因而具有一定的使用期限，生产上需要定期更新菌种。菌种保藏就是采用适当的技术手段保持菌种不污染杂菌，原初的生物学性状及活力不衰退、不发生变异，从而保障生产需要。目前常用的菌种保藏方法有定期移植法、液体石蜡油保藏法、液氮超低温冻结法、-80℃低温冷冻保藏等。已有的研究表明，用液氮超低温保存菌种已被公认为保持菌种特性不变和存活力持久最为理想的方法。液氮保藏法，亦称超低温保藏法，主要利用微生物在低于-130℃的低温下新陈代谢趋于停止的原理，在超低温液氮中有效地进行菌种保藏，此法操作简便、高效，保藏期一般可达到15年以上，是公认的菌种长期保藏技术之一，并且适用于各类微生物菌种的保藏。本申请从培养基筛选、保护剂配置、液氮降温及复苏程序等方面进行参数优化，寻找一种适合食用菌菌种的液氮超低温保藏的新保护剂配置方法和降温程序，为食用菌的科学研究与生产应用提供菌种保障。

发明内容

在上述背景条件的前提下，本发明提供了一种由保藏用培养基配方、保护剂配置、液氮降温及复苏程序等步骤组成的液氮超低温保藏方法，以解决食用菌菌种在保藏过程中偶然出现的菌种不活或活力下降的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种食用菌菌种新保护剂配置方法，包括以下步骤：

(1)配置菌种保藏用琼脂培养基，倒人无菌培养皿内制成平板，然后在平板中心接种，适温条件下培养至菌丝发满平板；

(2)沿菌落边缘将琼脂菌丝块分成约2mm³的小块，转接100～150块到装有20ml的保藏用液体培养基的烧瓶中，所述保藏用液体培养基包括：麦芽糖10g/L，KH ₂PO₄ 1g/L，pH自然；

(3)以每3分钟105μl的频率向该烧瓶中添加无菌4M山梨醇，共10次30分钟，每次添加后摇匀，黑暗条件下，在转速为60转/分的旋转摇床上室温孵育24小时；

(4)以每3分钟117μl的频率向该烧瓶中添加无菌4M山梨醇，共10次30分钟，每次添加后摇匀。黑暗条件下，在转速为60转/分的旋转摇床上室温孵育24小时；

(5)将孵育结束的烧瓶置于冰浴中，以每3分钟添加117μl的频率向该烧瓶中添加二甲亚砜(DMSO)，共10次30分钟，每次加入后都要摇匀烧瓶；添加结束后，将烧瓶静置30分钟；

(6)向冰上预冷的保藏管中分注1-1.5ml上述菌种保藏液，含琼脂块10～15块，瓶盖旋紧；

(7)采用降温程序对保藏管进行降温，降温后转置于液氮容器中(-196℃)。

其优选的技术方案为：

如上所述的一种食用菌菌种新保护剂配置方法，所述保藏用琼脂培养基包括: