[发明专利]一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法

说明书

本发明公开了一种基于催化发夹组装‑动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，包括如下步骤：提取待测样品中的端粒酶，催化发夹组装产物获得和动态光散射检测得到信号，实现对端粒酶活性的高灵敏检测。本发明提供的端粒酶活性检测方法操作简单，成本低，所需样品少且特异性好，利用该方法能够检测多种癌症患者尿液中的端粒酶活性，尤其在膀胱癌的无创诊断方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法。

背景技术

端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，能够防止染色体DNA的降解、末端融合、非正常重组等。在正常体细胞中，端粒长度随着细胞的周期分裂递减，最终导致细胞无法继续分裂，使细胞寿命受到限制，防止细胞过度分裂。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能以自身RNA为模板，在染色体末端延伸TTAGGG重复序列以维持端粒长度。研究表明，端粒酶活性在大多数正常体细胞中被抑制，但在85-90％的肿瘤细胞中被高度激活，如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等。因此，端粒酶被认为是癌症早期诊断的潜在生物标志物，端粒酶活性的有效检测对生物医学研究具有重要的意义。

目前，基于聚合酶链反应(PCR)的端粒重复序列扩增法(TRAP)是检测端粒酶活性的常用方法。然而，该方法存在操作复杂，费用昂贵以及易受诸多因素的干扰而产生假阳性结果等问题。近年来，人们又开发了一些无需PCR反应的端粒酶活性检测方法，例如等温核酸扩增法，比色法、荧光分析法、电化学分析法和化学发光法等。尽管这些方法可以避免PCR反应的缺点，但也存在一些不足，如程序复杂、灵敏度低和特异性差等。因此，开发一种灵敏度高、选择性好、可操作性强的端粒酶活性检测方法是癌症早期诊断中急需解决的问题。

催化发夹组装(catalytic hairpin assembly，CHA)，作为一种新型的无酶级联扩增策略备受关注。其原理主要是在目标物的作用下，引发链诱导发夹探针进行组装，然后被置换出来引发下一轮反应，起到类似催化剂的作用，从而实现目标物检测信号的放大。动态光散射技术(Dynamic Light Scattering，DLS)是一种常用光学测量技术，可以用来测定直径在0.5nm～6μm之间颗粒大小，由于它的高灵敏度，已成为一种重要的分析工具。DLS技术被广泛应用于疾病相关的生物分子和金属离子的检测。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，通过测定催化发夹组装产物的动态光散射信号，实现对端粒酶活性的高灵敏检测，具有灵敏度高、选择性好、特异性好和可操作性强的有益效果，能够有效检测待测样品中端粒酶的活性。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种基于催化发夹组装-动态光散射技术的端粒酶活性检测方法，包括以下步骤：

S1、端粒酶提取：利用CHAPS法提取待测样品中的端粒酶，得到待测端粒酶提取物；

S2、催化发夹组装产物获得：将待测端粒酶提取物与端粒酶引物在延伸反应缓冲液进行延伸反应，得到延伸产物，然后在延伸产物加入金纳米粒子探针，在温度为25-40℃进行催化发夹组装反应，得到催化发夹组装产物；

S3、动态光散射检测：催化发夹组装产物通过动态光散射测量粒径大小得到动态光散射信号。

优选的，所述步骤S2中的端粒酶引物序列为：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3`；所述延伸产物序列为：5`-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AGGG TTA GGG-3`。

优选的，所述步骤S2中的金纳米粒子探针混合物包括发夹探针H1修饰的金纳米粒子(AuNPs-H1探针)和发夹探针H2修饰的金纳米粒子(AuNPs-H2探针)。