[发明专利]一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法

权利要求书

1.一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，其特征在于，包括：

(1)移种：将种子液移入发酵培养基中；

(2)发酵：发酵60h，维持pH值6.8-7.2，第0-7h控制发酵培养温度为37±1℃，第8-60h的发酵温度25±1℃；期间补料，并调整搅拌速度，控制溶氧量为20％-30％；

步骤(1)所述发酵培养基含有：酵母膏43.0-48.0g/l、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l；

步骤(2)所述补料为补加乳糖和甘油；

所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD₆₀₀≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％±0.1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％±0.1％的乳糖；

所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100±1L/h；第8-18h，流加补入甘油75±1L/h；第18-30h，流加补入甘油85±1L/h；第30-40h，流加补入甘油90±1L/h；第40-50h，流加补入甘油95±1L/h；第50-60h，流加补入甘油100±1L/h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，第0-7h控制发酵培养温度为37℃，第8-60h的发酵温度25℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD₆₀₀≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％的乳糖。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100L/h；第8-18h，流加补入甘油75L/h；第18-30h，流加补入甘油85L/h；第30-40h，流加补入甘油90L/h；第40-50h，流加补入甘油95L/h；第50-60h，流加补入甘油100L/h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的菌体接种量为1.25％(v/v)。

6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)之前还包括种子制备步骤，制备的步骤为：

a.制备摇瓶菌悬液：取出甘油管，自然解冻后接种至无菌摇瓶中的培养基，pH7.0-7.2、37℃条件下摇床培养15-17h；

b.制备一级种子：将步骤a中的摇瓶菌悬液接种至一级种子罐中的一级培养基，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；

c.制备二级种子：将步骤b的一级种子接种至二级种子罐中的二级培养基，在pH6.9-7.5、37℃条件下培养5-6h；

步骤a所述培养基含有蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、氯化钠10g/l。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤b所述一级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤c所述二级培养基含有蛋白胨12g/l、酵母膏6g/l、氯化钠10g/l。

9.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(3)之后还包括酶活检测步骤。

10.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于，所述酶活检测步骤为：富集发酵菌体，加水定容至原体积，均质后，得到均质液，再使用头孢菌素C作为底物，使用电位滴定的方法测定酶活。