[发明专利]一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法

说明书

本发提供了一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，它包括补加乳糖和甘油的工艺；所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD₆₀₀≤50时一次性补入1％乳糖，在6‑60h随补料(甘油)流加1％的乳糖；所述补加甘油的工艺是：6‑8h，流加补入甘油100L/h；8‑18h，流加补入甘油75L/h；18‑30h，流加补入甘油85L/h；30‑40h，流加补入甘油90L/h；40‑50h，流加补入甘油95L/h；50‑60h，流加补入甘油100L/h。本发明的发酵方法得到的发酵产物酶活超过170U/ml，应用前景良好。

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，尤其涉及一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法。

背景技术

7-氨基头孢氨酸(7-ACA)是合成头孢类抗生素的关键性中间体，在其活性基团连接不同的侧链就构成不同性质的头孢类抗生素。世界上医药工业发达的国家均十分重视7-ACA的研究和生产。

一步酶法是生产7-ACA的常用技术。头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶，CCA)是一步酶法生产7-ACA的关键酶，能够将原料头孢菌素C(CPC)直接催化，脱去7-位的D-d氨基己二酰侧链，生成7-ACA。作用分子式如下：

头孢菌素C酰化酶主要靠基因工程菌发酵培养获得。为了提高酶的表达量和活性，研究人员不断尝试筛选发酵性能优越的菌株，或者构建基因工程菌株(内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达，华东理工大学学报(自然科学版)，2015)。但目前鲜有对发酵工艺改进的报道，主要是因为头孢菌素C酰化酶的发酵过程非常复杂，涉及培养基、发酵温度调节控制(包括温度和对应时间)、补料种类、补料时机、补料速度等诸多条件相互配合，优化获得一个比较好的发酵方法较为困难。

发明内容

本发明的目的是，提供一种简单、高效的头孢菌素C酰化酶的发酵工艺，具体技术方案包括：

一种头孢菌素C酰化酶的发酵方法，包括：

(1)移种：将种子液移入发酵培养基中；

(2)发酵：发酵60h，维持pH值6.8-7.2，第0-7h控制发酵培养温度为37±1℃，第8-60h的发酵温度25±1℃；期间补料，并调整搅拌速度，控制溶氧量为20％-30％；

步骤(1)所述发酵培养基含有：酵母膏43.0-48.0g/1、氯化钠3.0-8.0g/l、磷酸氢二钠8.0-13.0g/l、磷酸氢二钾4.17-4.22g/l、硫酸钠0.71-1.10g/l、硫酸镁1.78-2.00g/l、硫酸铵2.68-2.98g/l、丙三醇19.4-20.8g/l、三氯化铁0.015-0.020g/l、消泡剂0.42-0.50g/l；

步骤(2)所述补料为补加乳糖和甘油；

所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD₆₀₀≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％±0.1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％±0.1％的乳糖；

所述补加甘油的工艺是：第6-8h，流加补入甘油100±1L/h；第8-18h，流加补入甘油75±1L/h；第18-30h，流加补入甘油85±1L/h；第30-40h，流加补入甘油90±1L/h；第40-50h，流加补入甘油95±1L/h；第50-60h，流加补入甘油100±1L/h。

如前述的方法，步骤(2)中，第0-7h控制发酵培养温度为37℃，第8-60h的发酵温度25℃。

如前述的方法，所述补加乳糖的工艺是：培养8h且40≤OD₆₀₀≤50时一次性补入占发酵培养基体积1％的乳糖，在第6-60h随甘油流加占发酵培养基体积1％的乳糖。