[发明专利]利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法，将优化的精氨酸脱亚胺酶基因融合在酵母表达载体BDM上，构建单拷贝表达载体；利用限制性内切酶EcoRⅠ、SPeⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ四个酶进行酶切，根据SpeⅠ和XbaⅠ粘性末端能互补配对的原则，通过反复酶切、连接和转化操作，获得含精氨酸脱亚胺酶的重组质粒，电转毕赤酵母后，在甲醇诱导下能高效分泌表达精氨酸脱亚胺酶。本发明所构建的多拷贝高效表达精氨酸脱亚胺酶可用于提高产量、降低成本，实现精氨酸脱亚胺酶的胞外分泌表达，适用于精氨酸脱亚胺酶的规模化生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种利用毕赤酵母分泌表达精氨酸脱亚胺酶及构建方法。

背景技术

目前，精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,ADI)作为一种精氨酸降解酶，不可逆的催化精氨酸生成瓜氨酸和氨，精氨酸对于人类来说是一种非必须氨基酸，正常的细胞可经尿素循环通过精氨酸-琥珀酸合成酶(ASS)以及精氨酸-琥珀酸裂解酶(AL)催化瓜氨酸生成精氨酸，但不表达(ASS)，从而自身不能合成精氨酸，因此，通过精氨酸降解酶切断精氨酸对肿瘤细胞的供给，有可能从根本上消灭或控制精氨酸营养缺陷型癌细胞生长。

现如今，制备精氨酸脱亚胺酶的方法包括化学合成法、微生物发酵法和酶法。化学合成法常常造成环境污染，环保大格局下化学合成法慢慢被取缔。微生物发酵法得到酶液常常含有大量杂酶，导致纯酶的获得成本较高。重组酶酶法合成由于反应条件温和、产率高、产物纯化简单而备受关注。这种方法涉及到一种酶——精氨酸脱亚胺酶，它可以将精氨酸水解成瓜氨酸和氨，目前，ADI来源有烟曲霉属真菌、蜡样芽孢杆菌、粉肠球菌、假单胞菌等等。

综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中，发酵法制备精氨酸脱亚胺酶的工程菌种目的蛋白表达含量较低，精氨酸脱亚胺酶纯化成本较高。

(2)现有技术中，重组酶法制备精氨酸脱亚胺酶，主要通过细菌胞内表达并纯化精氨酸脱亚胺酶，整合有精氨酸脱亚胺酶基因的工程菌种，菌体能够对底物进行转化制备瓜氨酸，但是通常对菌体进行高密度发酵过程中，因为工程菌无法承受外源酶的高负荷表达，导致高密度发酵后期菌体裂解或者酶活急剧下降，从而限制了该酶在工业生产中的高效大规模利用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种毕赤酵母胞外表达精氨酸脱亚胺酶的工程菌种构建方法。

本发明中的ADI来源于粪肠球菌，所述表达精氨酸脱亚胺酶

(Arginine deiminase[Enterococcus faecalis CBRD01])

的DNA序列为Sequence ID:ESU74366.1(SEQ ID NO：1)。

本发明的另一目的在于提供一种实现精氨酸脱亚胺酶高效胞外分泌表达的工程菌种构建方法包括：

步骤一，根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的精氨酸脱亚胺酶基因序列设计引物F、R，(SEQ ID NO：2)以大肠杆菌基因组为模板扩增精氨酸脱亚胺酶基因，凝胶电泳条带约为1224bp，序列为：(SEQ ID NO：1)；

步骤二，将PCR产物精氨酸脱亚胺酶基因进行纯化，连接到BDM载体上，得到重组质粒efADIm₃-BDM，菌落PCR验证后送去测序；测序结果表明精氨酸脱亚胺酶原基因成功插入至载体BDM。

步骤三，利用4种限制性酶切酶EcoRⅠ、SPeⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ进行酶切，酶连，依次得到串联的表达盒式结构的质粒。

进一步，步骤二中，重组质粒efADIm₃-BDM含有由起始信号元件醇氧脱氢酶强启动子α-因子信号肽基因及融合在起始信号元件C端的精氨酸脱亚胺酶基因和终止信号。