[发明专利]一种区分曼地亚红豆杉不同品种的方法

权利要求书

1.一种根据转录组测序数据开发的曼地亚红豆杉SSR引物对组，其特征在于包括MDY61、MDY100、MDY101、MDY125、MDY328和MDY416；

2.一种区分不同品种曼地亚红豆杉的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)、采取改良CTAB方法对曼地亚红豆杉的基因组DNA进行提取，具体如下：

1-1：将曼地亚红豆杉叶片置于研钵中，用液氮研磨至粉末；

1-2：将100mg粉末加入600μL 2×CTAB试剂，轻轻摇动混匀；

1-3：置于65℃水浴槽中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；

1-4：常温冷却1min后加入600μL氯仿剧烈振荡混匀；

1-5：12000rpm离心5min；

1-6：取400μL上清液加入上述上清液3/4体积的异丙醇，缓慢颠倒混匀，出现的白色絮状沉淀物即为基因组DNA；

1-7：12000rpm离心5min，去上清；

1-8：加入300μL 75％乙醇轻轻洗涤管壁；

1-9：12000rpm离心2min，去上清；

1-10：倒立置于铺开的纸巾上，风干去乙醇；

1-11：用20μL双蒸水溶解沉淀的DNA，1％琼脂糖检测，余下的保存于-20℃；

步骤(2)、SSR-PCR体系

总反应体积为20μL，具体包括10μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，权要求利1所述SSR引物对组的上、下游引物各0.5μL，1μL 50ng/μL模板DNA，8μL的ddH₂O；

SSR-PCR条件如下：94℃预变性5min；32个循环，其中每个循环包括94℃变性30s，不同引物Tm值复性30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min；

(3)电泳检测

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳对步骤二获得PCR产物进行电泳检测，通过区分度较好的SSR引物进行综合分析。