[发明专利]一种区分曼地亚红豆杉不同品种的方法

说明书

本发明公开一种区分曼地亚红豆杉不同品种的方法。根据转录组测序数据开发的曼地亚红豆杉SSR引物对如SEQ ID NO.1‑54所示。本发明通过筛选曼地亚红豆杉转录组引物，利用电子PCR技术与退火温度的控制，能有效筛选出多态性高、条带清晰、重复性稳定的分子标记体系，可快速准确鉴定出泰斗、绿星、紫科、绿鹰4个不同品种曼地亚红豆杉。

技术领域

本发明属于SSR引物开发领域，具体涉及一种基于转录组数据开发曼地亚红豆杉SSR引物及区分曼地亚红豆杉不同品种的方法。

背景技术

红豆杉是一种全世界公认的珍稀濒危物种。红豆杉属的植物种群在自然环境下竞争力低、生长速度缓慢，并且因为其自身的地理隔离问题存在一定的局限性，因此自然界中的红豆杉属植物日渐稀少。同时，随着对红豆杉的植物提取物紫杉醇的不断开发利用，对其需求量逐年增大，使其种群资源受到严重破坏，野生种群濒临灭绝。红豆杉科有5个属，分别是穗花杉属、榧树属、澳洲红豆杉属、白豆杉属和红豆杉属，主要分布于寒温带、温带和亚热带地区。红豆杉树木作为紫杉醇、紫杉醇合成前体物和衍生物的天然来源，无论是对于紫杉醇的直接提取，还是紫杉醇的生物合成、化学合成及组学研究而言都有着极高的价值。曼地亚红豆杉Taxus media是东北红豆杉T.cuspidata和欧洲红豆杉T.baccata的天然杂交种，属于红豆杉属，其枝叶中含有较高的紫杉醇，是提取紫杉醇的优质原料。自从发现曼地亚红豆杉中含有较高的紫杉醇后，经过不断地栽培和选育，现在曼地亚红豆杉已经扩充至近20个品系。对当前存在的品种的进行遗传多样性的评价可以为优良品质的选育、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供可预见性的指导。有研究表明，不同产地、不同生长年限的曼地亚红豆杉中3种紫杉烷类活性成分量存在着差异。因此，如何对曼地亚红豆杉的种质进行准确的分子鉴定对其优良品质的筛选和培育十分重要。

特异性分子标记具有重现性好，扩增靶序列在基因组中位置确定等优点，因而倍受研究者青睐，最常用的特异标记是微卫星序列或简单重复序列(SSR)。SSR是一类一般由2～6个核苷酸为重复单位组成的核苷酸的串联重复序列，分布在基因组中的不同位置，并且具有良好的重复性和稳定性。SSR标记最大的优点在于其产物进行测序胶电泳分离具有单碱基的高分辨率，能检测很高的多态性，遗传信息量较大。

随着高通量测序技术的不断发展，转录组测序技术相比于基因组测序更易拼接，同时基于转录组建立的SSR标记是根据基因本身的差异而建立。迄今为止，尚未有关于曼地亚红豆杉SSR标记开发及应用的研究报道。因此，基于曼地亚红豆杉转录组数据库大规模开发SSR引物，对于曼地亚红豆杉品种鉴定和遗传多样性分析等研究具有重要作用。

发明内容

本发明的第一个目的是针对目前缺乏曼地亚红豆杉SSR标记引物的不足，提取基于转录组序列开发的SSR标记引物。本发明利用转录组数据有着基因功能注释的特点，开发的分子标记可以有针对性的补充与曼地亚红豆杉品质相关的候选分子标记，为曼地亚红豆杉种质资源多样性分析和性状关联分析提供有效标记，为进行曼地亚红豆杉的遗传多样性研究、重要性状基因定位及分子标记辅助育种等研究起到重要的推动作用，进而制定种质资源的保护策略。同时本发明利用曼地亚红豆杉转录组数据开发的分子标记还可以克服盲目的开发、筛选、使用SSR标记的缺点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种根据转录组测序数据开发的曼地亚红豆杉SSR引物对，具体分别为：

本发明的第二个目的是提供上述基于转录组序列开发的SSR标记引物的筛选方法，通过GMATAv2.2软件，对曼地亚红豆杉的转录组数据进行分析获得；具体如下：

步骤(1)、选取曼地亚红豆杉新鲜叶片材料，液氮研磨转移至-70℃下保存；采用试剂盒的方法提取总RNA并进行转录组测序文库构建。