[发明专利]一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用

说明书

本发明公开了一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用，属于环境微生物领域。具体过程为：选取至少2种菌种，富集培养后，在以目标污染物为单一碳源和能源的无机盐培养驯化，利用2,6‑二氯酚靛酚生物试剂的颜色变化，连续监测菌液OD₆₀₀，绘制菌种的生长曲线图，通过相同时段内菌种生长量来比较菌种对石油烃降解能力的强弱。本发明能够在短时间内比较多种不同菌种对石油烃的降解能力，以解决现有技术缺陷。具有实验操作简单，周期较短，有机溶剂用量少等优点。比较菌种石油烃降解能力的强弱，可以快速选取能最佳降解目标污染物的微生物，为石油污染的土壤修复提供尽可能多的菌种资源。

技术领域

本发明涉及一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用，属于环境微生物领域。

背景技术

微生物在环境中广泛存在，当环境受到石油烃类物质污染时，微生物为了生存会产生适应性变化，而不能适应环境变化的微生物被淘汰，从而留下能够降解石油的优势微生物。在未受污染的生态系统中，石油烃降解为生物所占比例不到0.1％，但在石油烃污染环境中，该比例会增加10-100倍。石油烃降解微生物被广泛地运用于石油污染物的治理和修复，包括细菌、真菌、放线菌以及藻类。其中细菌种类最多，也是最主要的降解活性物质，它们对石油烃组分的降解遵循优先降解顺序：正烷烃＞支链烷烃＞单方烃＞环烷烃＞芳香烃＞多环芳烃＞沥青烯烃等。

为了对比不同微生物对石油碳氢化合物的代谢能力，本发明提供一种关于不同菌种对石油烃降解能力的比较方法。本发明能够在短时间内比较多种不同菌种对石油烃的降解能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对现有判别降解菌对石油烃降解能力差异耗时较长的问题，提供了一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

(1)菌种的来源：已公布的石油烃降解菌。

(2)菌种的活化培养：选取至少2种菌种，分别投入100mL灭菌的LB液体培养基中，并添加1％的原油，富集培养3-7d。

(3)菌种的驯化培养：分别在以葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物为单一碳源和能源的无机盐培养基中加入1％富集培养的菌液，36℃，120rpm，培养3-7d。

(4)菌悬液配制：取50mL菌液于灭菌的离心管，4000转，离心10min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水50mL悬浮沉淀物后再次离心，如上所述洗涤3次后，用紫外分光光度计测定菌悬液浓度。

(5)菌种生长曲线：用酶标仪连续测定菌液的OD₆₀₀，绘制菌种的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。

进一步的，所述的LB液体培养基，其特征在于，LB液体培养基的成分为胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，pH值：7.0-7.4。

进一步的，所述的无机盐培养基，其特征在于，无机盐培养基的成分为KH₂PO₄：1.0g/L，K₂HPO₄：1.0g/L，NH₄NO₃：1.0g/L，MgSO₄·7H₂O：0.2g/L，FeCl₃：0.05g/L，CaCl₂·2H₂O：0.02g/L，pH：6.8-7.2。

进一步的，所述的菌悬液配制，其特征在于，实验操作均在超净工作台内或酒精灯附近完成，确保无空气中的杂菌污染。洗涤所使用的生理盐水需灭菌，移取菌悬液的注射器需灭菌。测定菌悬液浓度所使用的具塞比色皿使用前浸泡于70％的乙醇溶液中。以无菌的生理盐水为空白参比，测定洗涤后的菌液浓度，将菌悬液的OD₆₀₀调至相一致。