[发明专利]一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法

说明书

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法，包括载体构建、转化农杆菌及扩繁备用、制备Flamingo bill外植体并进行预培养、侵染、愈伤诱导与共培养、新茎尖形成及伸长、新生植株的切割及转移、嫁接与筛选等步骤。本发明采用的Flamingo bill外植体，不受采样季节限制，可以长年进行辣椒组织培养及遗传转化，克服了现有技术的外植体取材时间上的制约，并克服了辣椒的再生周期长的问题，大大缩短了获得转基因辣椒后代的时间；提供了采用新的侵染方式及新生植株切割方式，大大的提高了辣椒的遗传转化率以及成活率，促进芽的伸长和生根，从而获得完整可持续生长的再生植株。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法。

背景技术

辣椒是一种重要的蔬菜和工业原料作物，遗传转化体系的建立是其基因工程遗传改良和功能基因组学研究的重要基础，而要进行辣椒的遗传转化，建立高效离体再生系统是重要条件之一。目前辣椒的遗传转化体系和离体再生系统还不完善，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。目前植物的植株再生主要通过幼苗外植体器官再生、花药培养和原生质体培养三条途径，其中通过原生质体培养来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。

对于辣椒的植株再生，一般通过外植体直接分化成苗、脱分化形成愈伤组织并再分化成苗、Flamingo bill成苗三种方式进行。其中，以幼苗子叶、茎尖和胚轴为外植体的植株再生，是目前在建立辣椒离体再生系统中，研究的最多的一个领域，具体为，利用子叶、茎尖、胚轴等作为外植体经脱分化形成愈伤组织，通过农杆菌的介导将目的基因引入辣椒受体，再通过辣椒体细胞发生途径获得再生植株。但是目前这些辣椒植株再生技术还停留在芽诱导阶段，而对于芽的伸长、生根困难的问题长期难以解决，因而辣椒的遗传转化和离体再生难以真正实现并应用，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。

在辣椒的离体再生体系中，Flamingo bill外植体是一种将幼苗去掉茎尖和一片子叶的特殊的外植体，由单片子叶、下胚轴、胚根组成，其切口部位为顶端分生组织所在区域，细胞生长速度快，分化能力强，另外Flamingo bill外植体不同于一般外植体，其具有完整植株的特性，在组织培养中其根系能够吸收营养物质供应顶部分生组织的生长和分化，而一般的外植体在培养中只是靠细胞膨大所引起的被动吸收。然而经过反复试验得知，Flamingo bill外植体介导的辣椒植株再生依然存在很多的缺点：（1）同样受芽伸长困难的限制；（2）从flamingo bill外植体上切下的小苗生根困难；（3）Flamingo bill外植体在固体MS培养基中转移容易导致根部死亡；（4）农杆菌介导的遗传转化在筛选的的过程中容易使Flamingo bill的母体植株死亡；（5）根系易出现带菌污染而致死亡。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于， 提供一种能够有效提高遗传转化率，植株萌发速度快，成活率高辣椒高效遗传转化及植株再生方法。

具体技术方案如下：

一种辣椒高效遗传转化及植株再生方法，包括以下步骤：

S1.载体构建；设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接 及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体。

S2.转化农杆菌及扩繁备用；将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用。