[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法

说明书

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备方法，制备方法包括：步骤一，VKVQ编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条约1200bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1245bp的VKVQ,其序列为SEQ ID NO:1以及后续相关步骤。该方法制备的疫苗通过免疫柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ真核表达质粒和原核表达蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，更具体的说，涉及一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法。

背景技术

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)是一类专性细胞内寄生的顶复门原虫，可引起严重危害集约化养鸡业生产的鸡球虫病。在无预防措施或预防失败(如因抗药性问题致药物无效)的情况下，鸡发病率可达30％-100％，致死率可高达80％。全球每年因鸡球虫病引起的经济损失超过30亿美元以上。目前对鸡球虫病的防控仍主要是执行“在饲料中添加各种抗球虫药进行药物防控”和“活卵囊疫苗进行疫苗防控”的技术方法。但鸡球虫广泛而严重的抗药性，以及活卵囊疫苗存在的潜在散毒风险使鸡球虫病的防控面临严峻挑战，新的抗球虫药物及疫苗研制成为亟待解决的问题。然而，人们至今对球虫与宿主细胞的详细互作机制尚无系统认识，造成新型抗球虫药物及分子疫苗的研制面临巨大困难。

顶膜抗原(Apical Membrane Antigen，AMA)是一种在顶复门原虫中高度保守的微线分泌蛋白，可以和棒状体分泌的颈部蛋白共同形成“运动结合体(Moving Junction)”，共同完成虫体与宿主细胞的粘附作用，是协助虫体进入宿主细胞的关键物质。在Bromley等的蛋白组学研究中发现，柔嫩艾美耳球虫不只一种顶膜抗原，并且出现在不同的发育阶段，所以分析可能这些蛋白分别在不同的入侵阶段发挥着类似的作用。本课题组在对广东株柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA的克隆时，获得了多个类似顶膜抗原的基因，分别对其功能进行研究，发现其中一种蛋白(这里命名为VKVQ，下述部分沿用)可以有效预防鸡体感染鸡球虫病。而迄今为止，尚无任何其他关于该蛋白对艾美耳球虫免疫保护性的研究。

发明内容

本发明的目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备及其在抗鸡球虫病中的应用方法，该方法制备的疫苗通过免疫柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ真核表达质粒和原核表达蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种柔嫩艾美耳球虫重组多肽疫苗VKVQ的制备方法，制备方法包括：

步骤一，VKVQ编码基因的克隆，根据鸡球虫基因序列设计上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4,进行PCR扩增、电泳得到一条约1200bp的片段，将该产物连接转化后得到序列全长为1245bp的VKVQ,其序列为SEQ ID NO:1；

步骤二，VKVQ真核质粒的制备，针对目的基因设计引物序列，上游引物SEQ ID NO:5和下游引物SEQ ID NO:6，通过PCR扩增、电泳得到PCR产物，回收目的片段并进行酶切反应，通过表达载体的处理以及酶切载体与酶切片段的连接构建VKVQ重组真核表达质粒，再通过连接产物转化、菌落PCR法鉴定转化克隆以及通过阳性克隆测序验证，最后通过质粒小提试剂盒进行质粒小提以及进行VKVQ真核质粒的表达验证；

步骤三，VKVQ蛋白的制备，针对目的基因设计上游引物SEQ ID NO:7和下游引物SEQ ID NO:8，通过基因扩增，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，然后进行表达载体的处理以及酶切载体与酶切片段的连接构建VKVQ重组原核表达质粒，再通过连接产物转化、菌落PCR法鉴定转化克隆，最后采用质粒小提试剂盒进行质粒小提以及进行VKVQ在表达菌中的诱导表达。