[发明专利]红嘴鸥MyD88蛋白克隆表达及多抗制备

说明书

本发明涉及红嘴鸥MyD88蛋白克隆表达及多抗制备，属于生物工程技术领域，本发明分析了红嘴鸥MyD88基因及该基因编码蛋白的一系列生物信息学，构建其原核表达载体，制备兔抗MyD88多克隆抗体，为进一步研究野生候鸟MyD88蛋白在固有免疫中的作用提供技术支持。制备获得的兔抗MyD88多克隆抗体，经琼扩法测定总IgG效价达到1:16，纯度较高，为进一步深入研究MyD88在红嘴鸥淋巴细胞的定位及功能提供了重要工具。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体的说，涉及红嘴鸥MyD88蛋白克隆表达及多抗制备。

背景技术

当动物机体受到外源病原微生物入侵时，会通过一组模式识别受体(patternrecognition receptor,PRR)对病原相关分子模式(pathogen-associated molecularpattern,PAMP)进行识别，如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、脂壁酸(Lipoteicho-icacid，LTA)、肽聚糖(Peptidoglycan， PNG)等各种病原体表明复合物和细菌、病毒的核酸类物质，以此激活固有免疫信号通路，产生巨噬细胞、树突状细胞等先天性免疫细胞帮助机体抵抗病原微生物感染。Toll样受体则是目前发现能调控机体免疫反应的一类重要模式识别受体，不仅能识别病原微生物调控免疫应答反应，启动固有免疫机制，其引发的信号通路还能引起适应性免疫反应的活化。

MyD88(myeloid differentiation factor88，MyD88)作为Toll样受体(Toll likereceptors，TLRs)信号通路中的关键转接分子，在多种疾病的发生和免疫调控中发挥重要作用。

红嘴鸥的迁徙存在疫病传播的风险，无论出于对红嘴鸥的保护，还是对兽医公共卫生把控，对其免疫调控机制的研究显得尤为重要。MyD88是TLR受体信号通路的中的关键分子，调查研究红嘴鸥该蛋白的基因结构，获得多抗，对揭示该野生鸟类在抵抗病原体感染和调控免疫应答中的角色，具有重要意义，同时也为进一步研究野生候鸟MyD88蛋白在先天免疫中的作用提供技术支持。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了红嘴鸥MyD88蛋白克隆表达及多抗制备，通过分析红嘴鸥MyD88基因及该基因编码蛋白的一系列生物信息学，构建其原核表达载体，制备兔抗MyD88多克隆抗体，为进一步研究野生候鸟MyD88蛋白在固有免疫中的作用提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种红嘴鸥MyD88蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种编码红嘴鸥MyD88蛋白的基因，所述基因编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种红嘴鸥MyD88克隆表达的方法，包括以下步骤：

1)分离红嘴鸥血液淋巴细胞，提取总RNA，将RNA反转录为cDNA；

2)设计特异性引物，在上下游引物的5’端分别插入EcoRⅠ和XhoI酶切位点，PCR扩增获得红嘴鸥MyD88基因；

3)将pMD18-T载体与纯化的MyD88基因进行连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α进行培养，将培养后的菌液提取核酸后采用PCR及EcoR I与Xho I双酶切方法进行双重鉴定，获得重组质粒pMD18-T-MyD88；

4)用EcoR I与Xho I酶切重组质粒pMD 18T-MyD88，获得目的片段MyD88。

所述的红嘴鸥MyD88克隆表达的方法，还包括以下步骤：

5)重组原核表达载体的构建