[发明专利]一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用

权利要求书

1.一种副溶血性弧菌噬菌体（Vibrio Parahemolyticus phage）VppYZU84，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2020242，保藏日期为2020年06月28日；所述副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84，其基因组中含有如SEQ ID NO.1所示的特征DNA序列。

2.权利要求1所述的副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84在检测食品或环境中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84检测食品或环境中副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备副溶血性弧菌大流行株特异性裂解培养液A试剂，其具体成分包括胰蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、CaCl₂、MgSO₄和副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84；

2）制备空白对照以及10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶ CFU/mL副溶血性弧菌大流行株标准菌株梯度悬液B试剂；将待测样品进行匀浆、稀释处理，获得待测样品稀释液；将不同浓度的B试剂分别与待测样品稀释液和步骤1）制备的A试剂混合，混匀，同时进行培养；

3）应用一对特异性引物对步骤2）获得的共培养物进行qPCR扩增，测定Ct值，按照公式△Ct= Ctx- Ct0，计算△Ct 值，其中，Ctx代表含有不同浓度菌株的共培养的Ct值，Ct0代表空白对照不含有菌株的共培养的Ct值；

4）根据△Ct值和B试剂标准菌株浓度的线性关系，计算样品中副溶血性弧菌大流行株存活细胞含量。

4.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤1）中，所述特异性裂解培养液中的各成分的浓度如下：胰蛋白胨1.0 g/100 mL，酵母浸出粉0.50 g/100 mL，NaCl 3.50 g/100 mL，CaCl₂ 0.11 g/100 mL，MgSO₄ 0.24 g/100 mL，副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84 10⁵ PFU/100mL；pH值为7.5。

5.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤2）中，所述培养的条件为：37℃共培养3 h，每隔30 min取出涡旋混匀1 min。

6.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述一对特异性引物是以副溶血性弧菌噬菌体VppYZU84基因组特征DNA序列为靶标的一对引物。

7.根据权利要求3所述的副溶血性弧菌大流行株活细胞含量的检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述一对特异性引物对如下所示：

VppYZU84-orf7-Fa：5'-GCGCCTCGGATGAATTTGTGG-3'

VppYZU84-orf7-Rb：5'-GCACAGGTGCAGGTTCTGGAC-3'。