[发明专利]鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备

权利要求书

1.一种鸡的CR2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码上述鸡的CR2蛋白的基因，其特征在于，所述基因编码如权利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种鸡的CR2的克隆载体或表达载体，其特征在于，所述克隆载体或表达载体含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.一种鸡的CR2克隆载体或表达载体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

S1、分离鸡法氏囊淋巴细胞，提取基因组RNA，使用随机引物将RNA反转录为cDNA，用ChCR2上下游引物扩增获得ChCR2全长基因；

S2、设计pET-32a-ChCR2-△TM的引物用于将ChCR2全长基因C端的跨膜区去掉，并在ChCR2-△TM基因片段两侧分别加入BamHI和SalI两个酶切位点，以S1中得到的ChCR2全长基因为模板，扩增获得目的片段，之后分别用BamHI和SalI酶切pET-32a载体，利用同源重组的方法将目的片段连接到载体上，获得质粒pET-32a-ChCR2-△TM。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：

S3、设计ChCR2全长基因片段两侧分别加入BamHI和HindIII两个酶切位点的引物，扩增目的片断，之后分别用BamHI和HindIII酶切pGEX-6P-1载体，利用同源重组的方法将目的片段连接到载体上，获得质粒pGEX-6P-1-ChCR2-△TM。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述ChCR2引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，pET-32a-ChCR2-△TM引物的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，具体步骤为:以S1中得到的ChCR2为模板，采用序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，PCR扩增得到ChCR2-△TM片段，在ChCR2-△TM基因片段两侧分别加入BamHI和HindIII两个酶切位点，获得质粒pGEX-6P-1-ChCR2-△TM。

9.一种鸡的CR2蛋白的制备方法，将权利要求4或5制备的鸡的CR2原核表达载体，转入Transetta感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，分别获得GST-ChCR2-△TM和His-ChCR2-△TM蛋白。

10.一种抗ChCR2蛋白多克隆抗体的制备，其包括如下步骤：将获得权利要求9获得的鸡的GST-ChCR2-△TM蛋白免疫BALB/c小鼠，接种方式为颈背部皮下多点注射，首免使用弗氏完全佐剂，分别于第三周和第五周进行二免和三免，二免和三免使用弗氏不完全佐剂，于加强免疫后三天取小鼠血清。