[发明专利]鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备

说明书

本发明提供了鸡CR2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备。提供了ChCR2蛋白的氨基酸序列和基因序列，构建了含有不同标签的ChCR2原核表达载体，利用大肠杆菌原核表达系统表达ChCR2蛋白，并对蛋白进行纯化。纯化后的蛋白能够制备效价较高的多克隆抗体。ChCR2基因，在鸡免疫系统中的作用十分重大。CR2能将先天性补体介导的免疫应答与病原体和外来抗原联系起来，通过与共价附着于靶标的C3d结合而产生的适应性免疫应答，其导致的细胞信号传导现象，能极大程度降低B细胞活化的阈值。B细胞在免疫系统中的位置举足轻重，所以本发明发现的ChCR2无论是从基础研究还是临床运用上的意义都是十分重大的。

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种鸡的新基因CR2(ChickenComplement Receptor 2，ChCR2)的克隆，蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体的制备。

背景技术

补体受体2(CR2，complement receptor 2)即CD21，是补体C3裂解片段C3d、C3dg等的受体，是一种B细胞表面具有跨膜区的糖蛋白，主要表达在成熟的B细胞和滤泡树突状细胞表面。人类CD4+和CD8+T细胞亚群、星形胶质细胞和咽上皮细胞上也能发现CR2的存在。CR2在成熟B细胞上表达，但在前B细胞或未成熟B细胞上不表达，在活化B细胞分化为浆细胞时也没有发现。CR2是C3/C4结合蛋白结构家族的成员，由补体激活(RCA，regulators ofcomplement activation)基因簇的调节子编码。由RCA基因簇表达的蛋白质具有包含约60个氨基酸的紧凑重复β-折叠蛋白的特征，其被称为短同源重复序列(SCR，short consensusrepeats)或补体调节蛋白(CCP，complement control protein)模块。

人CR2一级序列由20个残基信号肽，15个SCR或16个SCR细胞外区域组成，分别包含951个氨基酸或1010个氨基酸，另外还有28个氨基酸残基的单通道跨膜区和34个氨基酸残基的细胞内区域。关于CR2的两种主要同种型，较短的15SCR同种型主要在B细胞上表达，而较长的16SCR同种型主要在滤泡树突细胞上表达，这是由于CR2基因的可变剪接产生的，这意味着成熟的CR2可观测到的长度可能为146kDa或148kDa。CR2的主要生理配体是C3d，分子量约为35kDa。除了C3d以外，CR2的配体还包括I型细胞因子，干扰素-α和低亲和力IgE受体，CD23(FcεRII)以及Epstein-Barr病毒(EBV)包膜蛋白gp350/220等。

CR2与其配体C3d之间的相互作用在B细胞的激活和启动免疫反应中起着不可或缺的作用。在B细胞表面，CR2与CD19以及CD81等分子相关联并形成B细胞共受体复合物，该复合物能够引起下游Syk和PI-3K等通路的激活。当存在大量抗原时，由B细胞共受体复合物和BCR的交联引起的信号传导现象是不明显的，因为单独的BCR复合物之间的交联足以产生相当的信号传导反应。然而，当抗原量不足时，例如在最初暴露于感染因子时，BCR与其共同受体复合物的共连接能够将B细胞活化的阈值降低10-1000倍。CR2作为补体受体是桥连先天免疫和获得性免疫的重要因子，在免疫系统中的作用举足轻重。人类、牛和鼠等哺乳动物的CR2基因鉴定并证实。但在鸟类中，CR2基因鲜有报道，尤其是家禽鸡的CR2基因还未曾被注释。

在本发明研究中，根据之前RNASeq的鉴定结果，首次通过PCR扩增得到了鸡的CR2基因，利用原核表达系统表达了ChCR2蛋白，通过纯化GST-ChCR2蛋白制备鼠抗ChCR2血清多抗。本发明研究不仅丰富了禽类的免疫学内容，而且为禽类的免疫系统的相关研究奠定了重要的基础。

发明内容

本发明的目的是根据CR2(CD21)在连接先天性补体介导的免疫系统和适应性免疫系统中的所发挥的关键作用，以及到目前为止鸡的CR2基因还尚未被注释，克隆得到鸡免疫系统的新基因ChCR2，不仅能够丰富禽类的免疫学内容，而且通过原核表达ChCR2蛋白并制备相应的多克隆抗体，还可以为禽类的免疫系统的相关研究提供基础。