[发明专利]一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法

权利要求书

1.一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，包括第一次三元溶液处理、第二次三元溶液处理、DnaseⅠ酶处理和第三次三元溶液处理四个步骤，其特征在于：所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：7～9：1～3配制而成；所述第一次三元溶液处理为将猪皮用三元溶液浸没，于70～80℃反应0.5～1.5h，然后将猪皮取出，放入去离子水中浸泡，待观察到皮片出现从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层的分层现象时，用取皮机切取猪真皮层；所述第二次三元溶液处理为将猪真皮层放入抽滤瓶中，加入三元溶液浸没，抽滤；取出皮片，置于广口瓶中，加入三元溶液浸没，于70～80℃反应1～10h，然后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感；所述DnaseⅠ酶处理为将无丝滑感的皮片与DnaseⅠ酶在密闭环境中以36～38℃条件下按照120～180r/m的转速反应80～100min，然后用磷酸盐缓冲液漂洗去除细胞残留物；所述第三次三元溶液处理为将经过DnaseⅠ酶处理后的皮片用三元溶液浸没，于70～80℃反应1～2h，然后将皮片取出，用去离子水冲洗，即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1：8：2配制而成。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述猪真皮层的厚度为1.4mm-1.8mm。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述猪真皮层的厚度为1.6mm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一次三元溶液处理的反应温度为75℃；所述第二次三元溶液处理的反应温度为75℃；所述第三次三元溶液处理的反应温度为75℃。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述第二次三元溶液的处理时间为4～6h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述第二次三元溶液的处理时间为5h。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述DnaseⅠ酶处理步骤中酶浓度为40U/ml，反应温度为37℃，转速为150r/m，反应时间为90～100min。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第三次三元溶液处理的时间为90min。

10.一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法，采用如下步骤：

(1)第一次三元溶液处理：将新鲜的猪皮切为7cm×7cm，置于广口瓶中，以固液比1：4加入三元溶液浸没后，置于75℃的水浴锅中反应1h，处理完成后将皮片取出，放入去离子水中浸泡清洗、冷却3h，每1h更换一次去离子水；待观察到皮片出现明显的分层现象时，用取皮机切取1.6mm厚的真皮层；所述分层现象是从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层；

(2)第二次三元溶液处理：将猪真皮层放入抽滤瓶中，再加入适量三元溶液至浸没，抽滤3次，取出皮片，置于250mL的广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应5h；处理完成后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感，每1h更换一次去离子水，除去多余的钙离子；

(3)DnaseⅠ酶处理：将皮片放入烧杯中，加入适量DnaseⅠ酶溶液后，用保鲜膜封口，放入37℃水浴锅中以150r/m的转速反应90min随后用磷酸盐缓冲液漂洗6次，每次15分钟，进一步去除细胞残留物；所述DnaseⅠ酶溶液为含40U/ml DNaseⅠ酶，10mmol/L氯化镁的磷酸盐缓冲液溶液；

(4)第三次三元溶液处理：将经过酶处理后的皮片置于广口瓶中，再以固液比1：10加入三元溶液至浸没后，置于75℃的水浴锅中反应90min，处理完成后将皮片取出，用去离子水中反复冲洗至无丝滑感，获得透明的猪脱细胞真皮基质皮肤替代物。