[发明专利]表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用

说明书

本发明公开了表达抗CD22嵌合抗原受体和PD‑L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用，涉及医药生物技术领域。表达载体插入有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD‑L1阻断蛋白的第二核酸。利用CD22靶标和PD‑L1靶标，通过靶向CD22的抗体或其片段，本发明的T细胞可高效、特异性地靶向表达抗原CD22的肿瘤细胞；PD‑L1阻断蛋白可以与内源表达的PD‑1竞争结合靶细胞上的PD‑L1，从而阻断PD‑1/PD‑L1信号通路，延长了本发明上述T细胞的作用时间，提高了肿瘤杀伤作用，由此缓解了实体瘤对CAR T细胞疗法的免疫耐受性的问题。

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体而言，涉及表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用。

背景技术

在肿瘤治疗领域，嵌合抗原受体T细胞疗法越来越受到人们的关注。嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)是被基因改造而具有嵌合抗原受体的T细胞，用于免疫治疗。

嵌合抗原受体(CAR)是一种人工构建的融合基因编码的跨膜分子，可将T细胞特异性靶向癌细胞表面的抗原，以消除靶癌细胞。CAR由胞外结构域(比如，抗体的单链抗体，scFv)、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外结构域的scFv负责特异性抗原的识别。胞内结构域负责信号的传导。当胞外结构域和抗原特异性结合之后，胞内结构域启动细胞活化所需的信号，从而促进T细胞的增殖、细胞因子的释放等。跨膜结构域将胞外结构域和胞内结构域连接。

第一代CAR将scFv与胞内信号传导域，比如CD3ζ连接，以诱导抗原特异性T细胞活化。随后的CAR并入单个(第二代)或多个(第三代)其他共刺激信号，比如CD28、4-1BB或OX40的结构域，以进一步增强和维持T细胞的效应子功能。

虽然CAR T细胞免疫疗法具有高靶向性、高杀伤活性等特点，但是由于免疫检查点分子，比如程序性死亡受体-1(PD-1)、细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)等的存在，肿瘤分子可使CAR T细胞失活，从而逃避CAR T细胞的杀伤。

PD-1是一种重要的免疫抑制分子。PD-1主要表达于T细胞、活化的T细胞、单核细胞和自然杀伤性T细胞(Keir等)中。PD-1的结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内尾部。PD-1属于协同抑制受体，有2个配体，分别为PD-L1和细胞程序性死亡-配体2(PD-L2)。PD-L1在不同的恶性肿瘤，如肺癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和胶质瘤中表达。在体内，PD-1与PD-L1或PD-L2的结合，下调抗原刺激的淋巴细胞增殖以及细胞因子的产生，最终导致淋巴细胞“耗尽”而诱导免疫耐受。实体瘤中的肿瘤细胞可上调PD-L1的表达，继而提供下调活化T细胞的信号，最终关闭免疫反应并诱导免疫耐受性。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了巨大的成功，但在实体瘤中却没有取得成功，克服实体瘤对CAR T细胞疗法的免疫耐受性，已经成为亟待解决的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一种表达载体，表达载体插入有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸；

PD-L1阻断蛋白为缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-L1，抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1阻断蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。