[发明专利]基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法

说明书

本发明公开了一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物、利用该引物制备的检测BVDV的试剂盒，以及基于CRISPR‑Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法，引物为：5’‑GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCCAUCCAACGAACUCACCACUGUUGCU‑3’；试剂盒中至少包含上述引物，将待测样品加入到试剂盒中进行检测。本发明首次将CRISPR‑Cas13a体系成功用于BVDV病毒的核酸检测中，只需加入微量级的样品，就可以鉴定是否含有BVDV病毒。具有良好的特异性、灵敏度。该方法为BVDV的早期诊断提供了广阔的前景。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法。

背景技术

牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)引起的一种接触性传染病，主要感染牛，也感染猪、羊、骆驼等其他生物，宿主范围较广。BVDV是一种正义的核糖核酸(RNA)病毒，属于黄病毒科和瘟病毒属。感染后可导致多种临床表现，包括呼吸道，消化道和生殖(多种形式)的病症( B,Roch F F,Richter V,et al.A meta-analysis of bovine viral diarrhoea virus(BVDV)prevalences in the global cattle population[J].Scientific reports,2018,8(1):1-15.)。其中，以牛、羊的急性或慢性黏膜病、腹泻、生长繁殖障碍、免疫抑制和持续性感染等症状为主，一旦感染,直接影响牛的生长发育和繁殖，部分会出现免疫力下降等情况,这就可以诱发其他病原体的感染。由于BVDV的宿主极其广泛，包括多数野生动物均可感染BVDV,并可携毒、排毒，这就加大了散养动物感染BVDV的概率。因此，BVDV严重威胁我国甚至全球的畜牧业发展，造成全球极大的经济损失。所以BVDV的检测及预防有着十分重要的意义(Garoussi M T,Mehrzad J,Nejati A.Investigation of persistent infection ofbovine viral diarrhea virus(BVDV)in Holstein dairy cows[J].Tropical animalhealth and production,2019,51(4):853-858.)。目前，检测BVDV病毒的方法很多，包括传统的血清中和试验，免疫组化法，ELISA和最近的荧光PCR技术。然而，传统的BVDV方法几乎都需要精密的仪器和较高的成本很难应对现场和大规模检测，假阳性的概率也比较高(Adams M J,Hendrickson R C,Dempsey D M,et al.Tracking the changes in virustaxonomy[J].Archives of virology,2015,160(5):1375-1383.)。因此迫切需要建立一种快速，准确，高效的方法来检测BVDV。