[发明专利]一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法

说明书

本发明公开了一种检测极端嗜盐生物中氨酰‑tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)制备具有功能元件表达框的重组表达载体；功能元件表达框包括如下元件：报告蛋白的编码基因、待测氨酰‑tRNA合成酶的编码基因、待测tRNA的编码基因；报告蛋白包括标签蛋白区段、SAMP1_G24amb蛋白区段；相对于SAMP1蛋白的第2‑87位的编码基因，SAMP1_G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个由甘氨酸密码子至“TAG”的替换；(2)将重组表达载体导入目标菌株；(3)在含有非天然氨基酸的环境中培养重组菌，检测报告蛋白。本发明可用于挖掘和鉴定极端嗜盐环境中的氨酰‑tRNA合成酶/tRNA工具资源，从而推动非天然氨基酸领域相关的应用。

技术领域

本发明涉及一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法。

背景技术

基因密码子拓展技术可通过基因编码的方式合成携带非天然氨基酸的蛋白质，为进一步拓展蛋白质的结构和功能开辟了新的路径，并在生物探针、成像、药物设计开发等多个领域展现出广阔的应用前景。

基于非天然氨基酸的应用，其先决条件是需要在宿主细胞体内引入高度正交的翻译工具(即，外源引入的翻译工具不能和宿主细胞中任何内源的tRNA、氨酰-tRNA合成酶、氨基酸或密码子相互反应)。如图1所示，该编码过程必须满足以下的条件：(1)使用空白的密码子用于非天然氨基酸的重新编码：目前，主流研究思路是利用琥珀终止密码子(UAG)来编码非天然氨基酸；(2)改造后的翻译工具酶(氨酰-tRNA合成酶)能够特异性地识别非天然氨基酸，并将其连接到对应的tRNA上；(3)被激活的tRNA能够特异性地识别空白密码子，并携带非天然氨基酸到核糖体用于翻译过程中多肽链的延长。

上述过程中，氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对是翻译编码过程中的核心工具，因此，开发高效、正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对是基因密码子拓展技术的重点研究内容。近年来，海量的基因组与宏基因组数据成为开发新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA的重要资源，通过生物信息学的深度分析挖掘，一些新型的翻译工具被挖掘和发现，具有开发成非天然氨基酸编码工具的潜力。然而目前待发掘的新型工具配对很多来自于非模式生物，包括极端环境中(高盐、高温、极端pH)的生物，通常面临工具不表达或者达活性低等问题，从而限制了新型工具配对的开发。综上所述，目前急需针对极端环境中新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具活性的检测系统，从而推动新型翻译工具的开发研究。

基于GFP(绿色荧光蛋白)的报告系统的示意图见图2。在蓝光到紫外线的激发作用下，GFP可发出绿色荧光，通过荧光显微镜观察或者使用酶标仪进行测量和定量。荧光蛋白能稳定内源表达，在定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。通过在GFP编码基因中的特定位置引入终止密码子，即可构造一个简单的报告蛋白表达的检测体系。当非天然氨基酸存在时，在外源翻译工具(包括可识别终止密码子的tRNA)的作用下，非天然氨基酸被特异性地引入在终止密码子的位置，从而产生全长的GFP，可被激发并发出荧光。当非天然氨基酸翻译工具没有活性或者底物不存在时，GFP的翻译提前终止，即不能产生具有荧光的全长的GFP。上述报告系统可以通过荧光的有无判断非天然氨基酸翻译工具的活性，且荧光的强度与翻译效率成正相关的关系，故被广泛应用于氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对的活性研究。虽然基于GFP的报告蛋白体系被广泛应用于非天然氨基酸工具的开发研究，但是该方法的使用场景具有一定的局限性。在极端生理环境下，GFP的表达和功能极易受到影响，所以不适用于针对极端环境生物中新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具活性的检测。此外，有一些微生物自身具有颜色，会与绿色荧光发生干扰，制约GFP报告蛋白体系的适用性。