[发明专利]一种大肠杆菌

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌，属于生物工程技术领域。本发明采用多位点多拷贝的生物学技术手段，将L‑氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α‑羟基羧酸脱氢酶基因整合到大肠杆菌染色体，使大肠杆菌具有更好的生长特性，高密度培养的菌株比原始菌株最终量可提高35％以上。将所述大肠杆菌应用于以多巴为底物的反应中，制备得到的产物产量可以显著得到提升。

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌，具体涉及染色体整合表达氨基酸氧化酶，葡萄糖脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶的大肠杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(L-amino acid oxidase as biocatalyst:a dream too far？Appl.Microbiol.Biotechnol.2013,97:9323-41)。绝大部份L-氨基酸氧化酶氧化氨基酸时会产生过氧化氢从而对自身或环境中的细胞产生毒性。自然界中还存在一类不产过氧化氢的氨基酸氧化酶，这些酶来源于变形杆菌属(Proteus sp.)、普罗威登菌属(Providenciasp.)、摩根菌属(Morganella sp.)等。通过相关文献报道这些菌体中的氧化酶从将氨基酸脱氢生成对应酮酸后，电子经过膜呼吸链传递给细胞色素氧化酶，最后与氧结合生成水，这类酶也被称为L-氨基酸脱氢酶或氨基酸脱胺酶。

葡萄糖脱氢酶是短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶NAD(P)⁺等存在时能够催化β-D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸内酯，而反应生成的D-葡萄糖酸内酯会自发地进一步水解成葡萄糖酸。目前，葡萄糖脱氢酶按其辅酶种类不同可分为3种：(1)NAD(P)⁺依赖型(EC1.1.1.47)，含这类酶的微生物有Gluconobacter suboxydans,Haloferax mediterranei,Bacillus cereus,Bacillus megaterium,Bacillus subtilis等；(2)FAD⁺依赖型(EC1.1.99.10)，含这类酶的微生物有Aspergillus niger,Burkholderia cepacia等；(3)PQQ依赖型(EC 1.1.5.2)，含这类酶的微生物有Pseudomonas fluorescens,Acinetobactercalcoaceticus,Mythylobacterium extorquens等。FAD⁺依赖型的会产生过氧化氢损伤细胞、PQQ依赖型的效率较低，而NAD(P)⁺依赖型的葡萄糖脱氢酶活性高稳定性好通常为全细胞催化反应提供辅酶再生。

α-羟基羧酸脱氢酶是一类分布十分广泛的脱氢酶类，尤其是在乳酸菌中，其是乳酸菌将丙酮酸转化为乳酸的关键酶。根据其催化生成产物的旋光性，可以分为D-乳酸脱氢酶(EC：1.1.1.28)和L-乳酸脱氢酶(EC：1.1.1.27)；乳酸脱氢酶广泛的存在于多种生物体中，随着全基因测序的出现，发现在很多乳酸菌中，不止存在一种乳酸脱氢酶的基因，同时它们的氨基酸序列不同，酶学性质也不同，因此功能也有差异。乳酸脱氢酶广泛分布于乳酸杆菌，芽孢杆菌，芽孢乳杆菌以及明串珠菌属四个菌属；除此以外，还分布在肉杆菌属(Carnobacterium)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)等。