[发明专利]一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1. 一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针SEQ-lighting，其特征在于该探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 如权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针SEQ-lighting，其特征在于该探针与非洲猪瘟病毒核酸序列p54的部分特异序列SEQ-p54特异结合，所述SEQ-p54的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的探针SEQ-lighting在制备用于非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。

4. 一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒，其特征在于包括检测滤纸片、p54部分特异序列SEQ-p54和DEPC-水溶液，所述检测滤纸片由9μL点亮RNA探针SEQ-lighting、64μL无细胞体外转录体系、1μL20 µM DFHBI、缓冲液10μL 140mM KCl、10μL 1mM MgCl₂、10μL10mM NaH₂PO₄、pH7.0滴加吸附在直径2mm的无菌滤纸片上，冷冻干燥后制得，所述点亮RNA探针SEQ-lighting的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述p54部分特异序列SEQ-p54的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备点亮RNA探针SEQ-lighting：从p54基因序列选取长度22bp的碱基，与Spinach中形成茎环结构的长度为54bp的碱基进行组合构建成RNA探针，对RNA探针进行全合成并构建RNA探针质粒pUC-RNA probe，转化大肠杆菌DH5a获得工程菌并培养，提取pUC-RNA probe质粒，采用限制性核酸内切酶NdeΙ进行线性化处理，获得RNA 探针的cDNA，进行体外转录，纯化浓缩后得到点亮RNA探针SEQ-lighting，所述点亮RNA探针SEQ-lighting的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，置于-80℃冰箱保存，备用；

（2）将步骤（1）得到的点亮RNA探针SEQ-lighting 9μL、64μL无细胞体外转录体系、1μL20 µMDFHBI、缓冲液10μL140mM KCl、10μL1mM MgCl₂、10μL10mM NaH₂PO₄、pH7.0滴加吸附在直径2mm的无菌滤纸片上，冷冻干燥后制得检测滤纸片，密封保存，所述无细胞体外转录体系包括转录酶系、NTP buffer Mix、100mM蔗糖；

（3）p54部分特异序列SEQ-p54，所述p54部分特异序列SEQ-p54的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

（4）步骤（2）得到的检测滤纸片、p54部分特异序列SEQ-p54与DEPC-水溶液构成检测试剂盒。

6. 如权利要求5所述的一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中大肠杆菌工程菌培养具体为：（a）配置LB液体培养基，包括NaCl 10g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，pH 6.8；（b）在培养基中加入终浓度为40 µg/mL的卡那抗生素，之后以接种比例1%接入含有pUC-RNA probe质粒的大肠杆菌工程菌；（c）于37°C，200 rpm的条件下培养14 h。

7. 如权利要求5所述的一种非洲猪瘟病毒点亮RNA探针检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中pUC-RNA probe质粒线性化处理具体为：处理体系由15μLpUC-RNAprobe质粒，2.5 μL10×Buffer，1μL酶，6.5 μL ddH₂O组成，处理条件为37°C 4 h，酶切后的产物使用San Prep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化回收。