[发明专利]产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物以及制备和使用所述前体的方法

权利要求书

1.一种制备为前体苄基异喹啉生物碱产物的代谢物的方法，所述方法包括：

用原料培养工程化的非植物细胞，所述工程化的非植物细胞包含三种编码序列修饰，其中所述三种编码序列修饰是对分别编码第一酶、第二酶和第三酶的编码序列的修饰，所述酶参与产生所述前体苄基异喹啉生物碱产物的代谢途径，

其中所述前体苄基异喹啉生物碱产物选自由以下组成的组：酪氨酸、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛、多巴胺、去甲乌药碱以及全去甲劳丹碱，以及

其中产生所述前体苄基异喹啉生物碱产物的参与所述代谢途径的所述第一酶、所述第二酶和所述第三酶中的每种选自由以下组成的组：TKL1、ZWF1、ARO1、ARO2、ARO3、ARO4、ARO7、TYR1、NCS、TYR、ARO9、ARO10、TyrH、DODC以及MAO。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述三种编码序列修饰中的每种选自由以下组成的组：反馈抑制减轻突变、转录调节、失活突变以及添加异源编码序列。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述前体苄基异喹啉生物碱产物选自由以下组成的组：酪氨酸、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛、多巴胺以及全去甲劳丹碱。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述前体苄基异喹啉生物碱产物选自由以下组成的组：酪氨酸、4-羟基苯乙醛、4-羟基苯丙酮酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸、3,4-二羟基苯乙醛、多巴胺以及去甲乌药碱。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞选自由以下组成的组：微生物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞以及酵母细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞在体外条件下培养。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞在体内条件下培养。

8.如权利要求2所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包含至少一种失活突变，所述失活突变增加所述前体苄基异喹啉生物碱产物的产生。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述失活突变影响对所述非植物细胞天然的酶的编码序列。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述失活突变涉及ZWF1酶的失活。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述失活突变涉及选自ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7以及SFA1的酶的失活。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述失活突变涉及选自ALD2、ALD3、ALD4、ALD5以及ALD6的酶的失活。

13.如权利要求2所述的方法，其中所述工程化的非植物细胞包含至少一种反馈抑制减轻突变修饰。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述至少一种反馈抑制减轻突变修饰影响对所述非植物细胞天然的酶的编码序列。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述至少一种反馈抑制减轻突变修饰影响选自ARO4和ARO7的酶。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述ARO4基因的所述至少一种反馈抑制减轻突变包括用亮氨酸取代位置229处的赖氨酸残基。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述ARO4基因的所述至少一种反馈抑制减轻突变包括用赖氨酸取代位置166处的谷氨酰胺残基。