[发明专利]产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物以及制备和使用所述前体的方法

说明书

提供工程化为产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体如去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的宿主细胞。所述宿主细胞可具有一种或多种选自以下的工程化的修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供适用于本发明方法中的使用所述宿主细胞和组合物例如试剂盒、系统等产生目标BIA或其前体的方法。

本申请为中国专利申请(申请日(进入日)：2016年06月16日，申请号：201480068628.3，以及发明名称为“产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物以及制备和使用所述前体的方法”)的分案申请。

政府权利

本发明是根据由美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的批准号1066100在政府支持下进行的。政府对本发明享有某些权利。

相关申请的交叉引用

按照美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2013年11月4日提交的美国临时专利申请序列号61/899,496的提交日期的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及微生物，特别涉及产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物，以及制备和使用所述前体的方法。

背景技术

苄基异喹啉生物碱(BIA)是一大组来自植物和其他生物体的次生代谢物。这些分子在人体中具有从所建立的吗啡和可待因的镇痛和镇咳特性至针对分子如黄连素和血根碱所观察到的针对癌症和感染的新颖活性范围内的治疗功能。供应所有这些BIA分子，以使得它们可供用于研究人员和医师是令人感兴趣的。合成反应的数目和用于选择性立体化学的要求意味着BIA的化学合成是低产率的并且不是用于大规模生产的可行手段。相反，对于广泛使用的药物可待因和吗啡，罂粟(opium poppy/Papaver somniferum)已培育且发育为生产作物。适用作药物和药物前体的吗啡生物合成中的中间体不会积聚，因为植物代谢演化为使至最终阿片样物质的途径通量最大化。即使对于最终产物代谢物像吗啡，积聚仅在芽和维管组织中的特化细胞内发生，并且需要在提取过程中对收获的植物材料进行严苛化学加工，其可产生按干重计少于2％吗啡。如此，用于制备BIA的方法是令人感兴趣的。

发明内容

提供工程化为产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体如去甲乌药碱(norcoclaurine)(NC)和全去甲劳丹碱(norlaudanosoline)(NL)的宿主细胞。所述宿主细胞可具有一种或多种选自以下的修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供适用于本发明方法中的使用所述宿主细胞和组合物例如试剂盒、系统等产生目标BIA或其前体的方法。

附图说明

本发明根据以下详细描述在结合附图阅读时得到最好理解。要强调的是，按照惯例，附图的各种特征不成比例。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸任意地放大或缩小。附图中包括以下附图。

图1示出从葡萄糖至酪氨酸以及其他BIA前体分子的生物合成途径。

图2示出ZWF1敲除和TKL1过度表达对戊糖磷酸途径(PPP)的作用。A：天然PPP通量，B：修饰的PPP通量。

图3示出从前体分子合成NC(A)和NL(B)。

图4示出在不同饲喂酪氨酸情况下四种遗传修饰对NC产生的作用。

图5示出从具有遗传修饰的组合的菌株产生NC。

图6示出醛氧化还原酶(ALD)/醇脱氢酶(ADH)基因敲除菌株中的NL产生的水平。