[发明专利]一种面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法

权利要求书

1.一种面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、人基因组DNA样品的制备：低熔点胶包埋法抽提完整的外周静脉血基因组DNA；

S2、人基因组DNA限制性内切酶消化与分离：进行人基因组DNA的限制性内切酶消化和酶切样品脉冲电泳分离；

S3、探针制备：制备EcoRI+Sacl双酶切分离插入的PI3E-11探针片段，电泳检测确定探针的纯度、长度和浓度；

S4、Southern转移、DNA分子杂交：进行Southern转移，探针标记，预杂交、杂交，洗膜、放射自显影；

S5、杂交条带分析及分子量测定：根据X光胶片，结合凝胶照片，测量出各片段的分离距离，利用曲线拟合法算出各杂交片段的大小，进行基因分析。

2.根据权利要求1所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S1、人基因组DNA样品的制备过程中先进行了外周静脉血ACD抗凝处理、白细胞分离处理。

3.根据权利要求2所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S1低熔点胶包埋法抽提完整的外周静脉血基因组DNA过程为：

(1)配制1％的低熔点琼脂糖凝胶，将低熔点琼脂糖凝胶加入细胞悬液管中，搅拌均匀，然后注入模具中，4℃保存使凝胶固化得到凝胶块；

(2)将凝胶块放入0.5M EDTA溶液中，再加入蛋白酶K，50℃消化40～50℃小时；

(3)取出凝胶块，吸出消化液，用Tris-HCL重复清洗2～3次；

(4)再用Tris-HCL、苯甲基磺酰氟裂解液、EDTA灭火残留蛋白酶K，纯化DNA样品。

4.根据权利要求1所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S2中人基因组DNA的限制性内切酶消化的具体过程为：用Tris-HCL对含基因组DNA的凝胶进行冰浴透析，然后用灭菌水清洗；配制50U EcoRI酶、50UXapI酶、50UBlnI酶、10×HBuffer，进行EcoRI及EcoRI/BlnI双酶切，XapI酶切，冰浴Buffer透析胶块20～30min，使凝胶块的内环境与内切酶反应条件平衡；吸出Buffer，用灭菌水清洗，超量酶切法进行消化。

5.根据权利要求1所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S2中酶切样品脉冲电泳分离过程为：配制1％的应用脉冲场电泳琼脂糖凝胶，1×TBE缓冲液，进行脉冲电泳分离，脉冲条件：4.5V/cm的恒定电压，1s/2h—1.5s/6h—5.0s/10h—25.0s/15h，电泳时间共30h。

6.根据权利要求1所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S3探针制备具体过程为：用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，以EcoRI+SacI双酶切分离插入的pI3E-11探针片段，电泳检测确定探针的纯度、长度和浓度，-20℃保存。

7.根据权利要求1所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S4中Southern转移是使DNA片段固定于尼龙膜上。

8.根据权利要求1所述的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S4中探针标记是指进行同位素标记。

9.根据权利要求8所述的的面肩肱型肌营养不良症的基因分析方法，其特征在于，步骤S4中预杂交、杂交是：将含有不同限制性长度DNA片段的尼龙膜，在核酸杂交炉中与65～70℃预杂交45～75min，加入同位素标记的探针后再进行杂交。