[发明专利]一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法

权利要求书

1.一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：包括，

(1)亲鱼培育：由G₂代家系苗种培育至4龄获得亲鱼；

(2)强化促熟培育：4龄亲鱼繁殖前3个月开始强化促熟培育，饲喂时补充卵磷脂及复合维生素；

(3)亲鱼选择：选择健康且第二性征清晰可辨的雌、雄亲鱼，所选雌鱼置于自制产卵袋内；

(4)雌性亲鱼的催产：雌性亲鱼注射催产素，促进排卵；

(5)制备精子溶液：雄性亲鱼麻醉后解剖，采集精巢组织制备精子溶液；

(6)收集卵子：雌性亲鱼麻醉后在其泄殖孔及腹鳍周围涂上一层植物起酥油，轻轻挤压雌性亲鱼腹部，卵子收集于事先涂布植物性起酥油的培养皿中；

(7)人工授精：向卵子表面加入适量精子溶液，使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌，加入更多的淡水浸没卵子，使已受精的卵子保持坚挺10～15min，即为可用于斑点叉尾鮰基因敲除、过表达研究的受精卵。

2.如权利要求1所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述G₂代家系苗种是由德克萨斯群体、阿肯色群体、密西西比群体、阿肯色群体、阿肯色群体中的一种或几种，通过逐代定向构建、培育而成。

3.如权利要求1所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述催产素包括绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂、多潘立酮(中的一种或几种。

4.如权利要求3所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述雌性亲鱼的催产，其为采用三针法，注射剂量以亲鱼体重计，第一针：促黄体素释放激素A₂ 50ug/kg；第二针：促黄体素释放激素A₂ 6ug/kg、多潘立酮3mg/kg、绒毛膜促性腺激素500IU/kg；第三针：促黄体素释放激素A₂ 3ug/kg、多潘立酮1.5mg/kg、绒毛膜促性腺激素250IU/kg，注射时间间隔为12h。

5.如权利要求4所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述雌性亲鱼注射催产素，其完成后放回水池，在水温20～25℃条件下，效应时间为14～20h。

6.如权利要求1～5任一项所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述自制产卵袋的规格为100cm×30cm，网眼大小为3mm，材料为软质尼龙网。

7.如权利要求1～5任一项所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(5)和步骤(6)中，所述麻醉，其使用的麻醉剂为0.1％的3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐。

8.如权利要求1～5任一项所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(7)中，经淡水浸没后获得的卵子能够同步受精和发育。

9.一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵，其特征在于：所述受精卵经显微注射后，其孵化率超过80％。

10.如权利要求9所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵，其特征在于：所述显微注射必须在人工授精后90min内完成。