[发明专利]一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法，该方法包括亲鱼培育、强化促熟培育、亲鱼选择、雌性亲鱼的催产、精子溶液制备、卵子收集、人工授精，通过该方法制备的受精卵经显微注射后，孵化率超过80％。本发明还提供了促进斑点叉尾鮰雌性亲鱼排卵的催产剂及其剂量，注射催产剂后可促进雌性亲鱼产卵并可实现人工取卵。根据本发明制备的斑点叉尾鮰受精卵可以保证其同步的发育，满足基因敲除、过表达等研究需要。

技术领域

本发明涉及鱼类的催产及人工授精方法，特别是涉及一种用于斑点叉尾鮰基因敲除 和过表达研究的受精卵制备方法。

背景技术

显微注射是分子和细胞生物学研究的一种常用实验技术，其主要通过毛细玻璃管将 微量物质(如DNA、RNA、蛋白质和其他大分子)输送到细胞或胚胎中。显微注射技 术已经被研究人员用于基因敲除、过表达和修饰等研究中。在对各种生物进行基因敲除、 过表达研究时一般需要在受精卵1细胞阶段开展显微注射，因而获得同步的受精卵则十 分关键。

斑点叉尾鮰鱼卵为粘性卵，数以万计的鱼卵黏着成较厚的卵块，且受精后胚胎发育 也不同步，不利于开展显微注射实验。尽管国内外已有多篇文献关于斑点叉尾鮰人工催产技术研究，但这些文献中亲鱼催产后均用于提高自然产卵率，使用文献中的催产剂和 剂量注射后并不能实现人工挤卵和人工授精。本发明的目的在于提供一种用于斑点叉尾 鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，使用该方法可保证受精卵保持同步受精， 且单层排列。本发明同时还提供了促使斑点叉尾鮰雌性亲鱼排卵的催产剂和注射剂量， 根据本发明提供的催产剂组分、剂量及注射方法，可以实现人工挤卵，完成人工授精。 根据本发明制备的斑点叉尾鮰受精卵可以保证其处于相同的发育阶段，满足基因编辑、 过表达等研究。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于斑点叉尾鮰基因 敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研 究的受精卵制备方法，其包括，(1)亲鱼培育：由G₂代家系苗种培育至4龄获得亲鱼； (2)强化促熟培育：4龄亲鱼繁殖前3个月开始强化促熟培育，饲喂时补充卵磷脂及复 合维生素；(3)亲鱼选择：选择健康且第二性征清晰可辨的雌、雄亲鱼，所选雌鱼置 于自制产卵袋内；(4)雌性亲鱼的催产：雌性亲鱼注射催产素，促进排卵；(5)制备 精子溶液：雄性亲鱼麻醉后解剖，采集精巢组织制备精子溶液；(6)收集卵子：雌性 亲鱼麻醉后在其泄殖孔及腹鳍周围涂上一层植物起酥油，轻轻挤压雌性亲鱼腹部，卵子 收集于事先涂布植物性起酥油的培养皿中；(7)人工授精：向卵子表面加入适量精子 溶液，使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌，加入更多的淡水浸没卵子，使已受精的卵子 保持坚挺10～15min，即为可用于斑点叉尾鮰基因敲除、过表达研究的受精卵。

优选的，步骤(1)中，所述G₂代家系苗种是由德克萨斯群体、阿肯色群体、密西 西比群体、阿肯色群体、阿肯色群体中的一种或几种，通过逐代定向构建、培育而成。

优选的，步骤(4)中，所述催产素包括绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂、多潘立酮(中的一种或几种。

优选的，步骤(4)中，所述雌性亲鱼的催产，其为采用三针法，注射剂量以亲鱼 体重计，第一针：促黄体素释放激素A₂ 50ug/kg；第二针：促黄体素释放激素A₂ 6 ug/kg、多潘立酮3mg/kg、绒毛膜促性腺激素500IU/kg；第三针：促黄体素释放激素 A₂ 3ug/kg、多潘立酮1.5mg/kg、绒毛膜促性腺激素250IU/kg，注射时间间隔为12 h。

优选的，步骤(4)中，所述雌性亲鱼注射催产素，其完成后放回水池，在水温20～25℃条件下，效应时间为14～20h。