[发明专利]一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法

说明书

本发明公开的是一种能够利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法，经过双酶切后插入到载体pET28a(+)相应的酶切位点上得到pET28a‑ST Ⅱ‑hGH重组载体，工程菌：含有pET28a‑ST Ⅱ‑hGH重组表达载体的大肠杆菌，表达人生长激素蛋白：将含有pET28a‑ST Ⅱ‑hGH重组表达载体的大肠杆菌，培养、诱导，收集表达了人生长激素蛋白的菌体；纯化重组人生长激素：菌体破碎、超滤、层析，加入核糖体结合位点避免使用昂贵限制性内切酶Nco Ⅰ，去除了pET28a(+)上多余序列，利用了载体原来的T7启动子来启动目的基因表达，常规载体实现人生长激素在大肠杆菌中的高效分泌表达，提高了生长激素的表达量。

技术领域

本发明涉及一种人生长激素的方法，更具体一点说，涉及一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

人生长激素(Human Growth Hormone,hGH)是由脑垂体侧翼的成群排列的生长激素细胞(α细胞)分泌的一种单一肽链、非糖化的亲水性蛋白质激素,含有191个氨基酸残基，分子量为21700Da，等电点为4.9。其主要作用是包括刺激骨、软骨细胞的生长和分化，以及调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现hGH还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松、心血管疾病等多种疾病。生长激素缺乏是导致儿童生长障碍重要的因素之一。现在重组人生长激素在临床上已广泛应用。

最早的hGH(20世纪50～70年代)也称为人垂体源性生长激素，它是从刚去世的人垂体中提取出来，是临床上最早应用的生长激素。其缺点是：①来源受限，产量稀少；②纯度较低，易产生抗体；③易受供体病毒污染，于1985年被美国FDA禁用。20世纪80年代早期：Genentech公司利用大肠杆菌(E.Coli)包涵体技术研制出含192氨基酸的基因重组人生长激素——Met-rhGH，其缺点是：①提取和复性工艺复杂；②易受到污染；③与人hGH不完全一致，易产生抗体，纯度和活性较低，因此也被淘汰，20世纪80年代中期，用普通大肠杆菌基因表达技术合成含有191个氨基酸的重组人生长激素，但由于其结构与人垂体生长激素具有差异，仍易产生抗体，另外其分泌和提取过程较为复杂，易受到污染或引入杂质而导致过敏反应，20世纪80年代末期，哺乳动物细胞重组DNA技术合成的含有191个氨基酸的重组人生长激素，该产品和天然的生长激素结构更为接近，但其缺点是：①细胞培养要求高、繁殖速度慢、收率低；②腺病毒污染——动物源性感染；③促增殖药物污染——肿瘤发生，20世纪90年代，用分泌型大肠杆菌基因表达技术合成的重组人生长激素，产物直接分泌于菌体之外。其氨基酸含量、序列和蛋白质结构与人垂体生长激素完全一致，生物活性、效价、纯度和吸收率极高，在最大限度降低治疗成本的同时确保了产品的安全性、有效性和稳定性，但是目前大肠杆菌分泌表达存在表达量不高，操作复杂，有的超低温表达对仪器设备要求较高等缺点，近年来也有利用酵母分泌表达hGH，可以大量表达hGH，但酵母表达周期长，培养基配置复杂，参数控制要求较高等缺点。

发明内容

针对现有技术的不足，本申请提供具有可提高生长激素的表达量，hGH更易于表达，成本低廉，易于实现等技术特点的一种利用大肠杆菌高效表达并分泌人生长激素的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种重组人生长激素核苷酸序列，该核苷酸序列依次包含限制性酶酶切切位点1、核糖体结合位点、信号肽编码区、人生长激素编码区、限制性内切酶酶切位点2，其中，信号肽为大肠杆菌热稳定肠毒素Ⅱ信号肽编码序列SEQ ID NO：1，hGH编码序列为SEQID NO：2所示。

作为优选，限制性酶酶切位点1为-XbaI酶切位点，限制性内切酶酶切位点2为xhoI酶切位点，核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

另一方面提供一种重组表达载体，通过以下方法获得：将核苷酸序列为SEQ IDNO：3经过双酶切后插入到载体pET28a(+)相应的酶切位点上，得到pET28a-STⅡ-hGH重组载体。