[发明专利]一种测定非变性胶原蛋白含量的方法

权利要求书

1.一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行测量，采用羟脯氨酸作为对照品，含非变性胶原蛋白的产品作为供试品；

所述供试品制备成供试品溶液的过程包括：

纯化：去除供试品中的变性蛋白获得纯化产物；水解：将纯化产物与酸溶液混合进行水解，水解后采用碱溶液进行中和，获得水解产物；衍生：将水解产物与衍生液混合进行衍生，衍生后采用终止液终止反应，过滤后获得供试品溶液；

采用对照品配置成不同浓度的溶液，衍生后获得对照品溶液；通过对照品溶液的检测结果获得羟脯氨酸的标准曲线，根据标准曲线查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度；

根据非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数a换算得出供试品中非变性胶原蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述供试品中非变性胶原蛋白的含量的换算公式为：

其中，X为供试品中非变性II胶原蛋白的含量，mg/g，

C为供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL，

V为供试品溶液的最终定容体积，mL，

m为供试品的质量，g，

a为非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数。

3.根据权利要求1或2所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述非变性胶原蛋白为非变性II型胶原蛋白，换算系数a为10.9。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述对照品溶液的配置过程为：采用羟脯胺酸配置成不同浓度的羟脯胺酸溶液，将不同浓度的羟脯胺酸溶液分别采用与供试品相同的衍生步骤处理获得对照品溶液。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述水解步骤中采用的酸溶液为浓度为4-8mol/L的盐酸溶液，水解温度为100-120℃，水解时间大于20h；所述中和所用碱溶液为浓度为4-8mol/L的NaOH溶液；

所述衍生步骤中采用的衍生液包括浓度为0.3-0.7mol/L NaHCO₃溶液和浓度为0.5-1.5％的DNFB乙腈溶液，衍生温度为50-70℃，衍生总时间为0.5-1.5h；所述衍生步骤中采用的终止液为浓度为0.05-0.15mol/L的KH₂PO₄。

6.根据权利要求5所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，

所述衍生步骤中过滤采用0.45μm的滤膜。

7.根据权利要求1-6任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法所采用的色谱条件包括：

色谱柱为C18色谱柱，检测波长为340-380nm，0.03-0.07M乙酸钠为流动相A,30-50％乙腈为流动相B，采用的梯度洗脱程序为：

8.根据权利要求1-6任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述供试品中去除变性蛋白获得纯化产物的过程为：

称取供试品，采用盐酸胍溶液进行溶解，在2-8℃放置16-24h，离心，去除上清液，加入包含蛋白酶抑制剂、碘乙酰胺、EDTANa₂的稀释液，2-8℃放置0.5-2h，离心，去除上清液，重复至少一次上述盐酸胍溶液和稀释液的洗涤步骤获得沉淀；向沉淀中加入蛋白酶溶液，于35-40℃搅拌反应至少24h，离心，去除上清液，水洗，离心，去除上清液，重复洗涤至少1次；干燥即可。