[发明专利]一种测定非变性胶原蛋白含量的方法

说明书

一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，包括采用羟脯氨酸作为对照品，通过高效液相色谱法对含非变性胶原蛋白的供试品进行含量测定；具体为：供试品通过纯化、水解、衍生等步骤制备成供试品溶液；采用对照品溶液获得羟脯氨酸的标准曲线，根据标准曲线查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度；再根据非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数a换算得出供试品中非变性胶原蛋白的含量。本发明可以有效测定产品中非变性胶原蛋白含量，检测结果准确。

技术领域

本发明涉及含量测定领域，具体涉及一种测定非变性胶原蛋白含量的方法。

背景技术

骨关节炎症和软骨磨损是由于人体自身免疫反应抵抗内源性II型胶原蛋白造成的，II型胶原蛋白必须是非变性的才具有功效。市场上改善关节的产品通常是由变性/水解II型胶原蛋白以及非变性II型胶原蛋白混合而成。非变性II型胶原蛋白通过一种称为口服免疫耐受的作用机制，在较小的剂量下就能发挥功效。

非变性II型胶原蛋白以原骨胶原同型三聚体的超螺旋结构存在于哺乳动物软骨中，是由三条相同的a1链组成，在哺乳动物透明软骨中含量非常丰富，约占软骨组织蛋白质总量的80％。三股螺旋结构是非变性II型胶原蛋白生物活性的一个重要标志，是其发挥功能特性的前提。然而，三股螺旋结构容易受加工环境的影响，加工过程中引入的物理热、辐照、剪切、酸及其他化学试剂，都会部分或完全破坏胶原蛋白的三螺旋结构，导致其失去天然的生物活性功能。

因此在保留非变性II型胶原蛋白三螺旋结构不被破坏的前提下，去除产品中变性/水解II型胶原蛋白干扰是准确定量测定非变性II型胶原蛋白含量的关键技术。

中国文献CN109627326A公开了一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法，该文献中虽然可以从产品中提取出非变性胶原蛋白，但获取的非变性胶原蛋白并不是纯品，其中还包括有非变性胶原蛋白以外的其他物质，不能准确获取非变性胶原蛋白的含量，且现有技术中并没有纯的非变性胶原蛋白作为参照，无法直接采用高效液相色谱法直接进行准确测定；因此，根据现有技术的记载只能实现非变性胶原蛋白的定性检测，无法有效实现非变性胶原蛋白含量的准确测量。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术中的检测方法无法准确获得产品中非变性胶原蛋白的含量的缺陷，从而提供一种能有效且准确测定非变性胶原蛋白含量的方法。

一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，采用高效液相色谱法进行测量，采用羟脯氨酸作为对照品，含非变性胶原蛋白的产品作为供试品；

所述供试品制备成供试品溶液的过程包括：

纯化：去除供试品中的变性蛋白获得纯化产物，

水解：将纯化产物与酸溶液混合进行水解，水解后采用碱溶液进行中和，获得水解产物，

衍生：将水解产物与衍生液混合进行衍生，衍生后采用终止液终止反应，过滤后获得供试品溶液；

采用对照品配置成不同浓度的溶液，衍生后获得对照品溶液；通过对照品溶液的检测结果获得羟脯氨酸的标准曲线，根据标准曲线查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度；

根据非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数a换算得出供试品中非变性胶原蛋白的含量。

所述供试品中非变性胶原蛋白的含量的换算公式为：

其中，X为供试品中非变性II胶原蛋白的含量，mg/g，

C为供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL，

V为供试品溶液的最终定容体积，mL，

m为供试品的质量，g，

a为非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数。