[发明专利]一株全人源抗人huOX40单克隆抗体

说明书

本发明公开了几种全人源抗人huOX40单克隆抗体，涉及高亲和力、低解离速率的抗人OX40单抗及其抗体片段。本发明在已构建大容量的全合成人源噬菌体抗体库基础上，利用磁珠偶联抗原法从中筛选获得了特异性抗人OX40单抗，和抗体工程改造后优选的几株高亲和力抗人OX40单抗，所述全人源抗人huOX40单克隆抗体能特异性地与人huOX40抗原结合,包含全人源框架区以及全人源轻链和/重链的CDR区,其亲和力得到极大的提升，能更有效的识别人huOX40抗原。

技术领域

本发明涉及基因工程产品，涉开了几株具有高亲和力的全人源抗人huOX40的特异性单克隆抗体。

背景技术

目前，抗体在同种异体免疫排斥、自身免疫反应抑制、抗血小板治疗、癌症治疗等方面的应用非常广泛，也展现了诱人的市场前景；但鼠源的单克隆抗体在临床重复给药时在体内会产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱甚至消失。因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的；抗体库技术的出现为这一问题的解决提供了一条新的途径，Winter等在1994年就创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，而且不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全利用基因工程技术制备人源性抗体。

噬菌体抗体库技术的特点：1.方法简单易行，节约时间，可通过发酵生产大量制备。2.选择范围广泛，可对百万至亿万个分子进行选择，获得高亲和力的人源抗体。3.可直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因或Ig的V区基因，因此可以获得完全人源化的抗体，克服了杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术。4.模拟了天然免疫系统亲和力的成熟过程，经过多轮突变，链置换和抗原选择等可创造出高亲和力的抗体。

OX40(CD134,TNFRSF4)，最初被定义为T细胞活化标记物，后发现是具有共激活功能的NGFR/TNFR超家族成员(Paterson DJ，et al,(1987)Mol Immunol.24:1281-1290)。OX40基因位于人1号染色体(小鼠4号染色体)，编码一种50kD的一型跨膜糖蛋白。胞外区有191个氨基酸，包含了三个完整的以及一个稍短的富含半胱氨酸结构域(CRDs)，主要由T细胞表达(结构性地由调节性T细胞表达，激活后由效应T细胞表达)。OX40的配体为OX40L，最初发现于HTLV-1转换的T细胞，被称为pg34，主要表达于APC，在NK细胞、肥大细胞和激活的T细胞上也有表达。OX40和OX40L的相互作用能够在OX40的胞内区域内招募TNFR相关(TRAFs)分子，形成包含IKKα和IKKβ以及PI3k和PKB(Akt)的信号传导复合物；OX40还与TCR信号协同作用，通过未知机制增强细胞内Ca2+，从而增强NFAT入核。OX40可激活经典的NF-κB1途径或非经典的NF-κB2途径、PI3k/PKB和NFAT途径，进而调控制T细胞分裂和存活的基因，以及促进细胞因子基因的转录以及细胞因子受体的表达，对于细胞存活至关重要。OX40信号传导会引起包括CTLA-4和Foxp3的下调(Gramaglia I,et al,(1998)J Immunol,161:6510–6517；Gramaglia I,et al,(2000)J Immunol,165:3043–3050；Murata K,et al,(2002)JImmunol,169:4628–4636)。

研究表明，在携带肿瘤的小鼠中，通过可溶性小鼠OX40L-免疫球蛋白融合蛋白可增强抗肿瘤免疫，导致小鼠恶性肿瘤细胞系的小鼠模型中出现无肿瘤生存(Sμgamura etal.Nature Rev Imm2004；4:420-431)。在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，通过抗人OX40抗体可增强肿瘤免疫，可抑制各种人类恶性肿瘤细胞系如结肠癌和前列腺癌等肿瘤生长。