[发明专利]一种以CD3为靶点的抗体药物对T细胞激活程度的检测方法

权利要求书

1.一种以CD3为靶点的抗体药物对T细胞激活程度的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

S1、构建并筛选稳定表达的工程细胞株Jurkat-NFAT-Luc，具体包括以下方法：

S11、构建NFAT活化因子的NFAT响应元件驱动的萤光素酶基因载体，所述NFAT响应元件的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

S12、在所述萤光素酶基因载体两端插入睡美人转座子末端反向重复序列，并构建转座酶的表达载体，所述睡美人转座子末端反向重复序列的左臂序列如SEQ ID NO:2所示，所述睡美人转座子末端反向重复序列的右臂序列如SEQ ID NO:3所示；

S13、所述转座酶的表达载体电转Jurkat细胞，筛选所述NFAT响应元件驱动的所述萤光素酶基因的稳定细胞株Jurkat-NFAT-Luc，所述转座酶为SB11，所述转座酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

S2、调整所述工程细胞株Jurkat-NFAT-Luc的细胞密度，并在U底板中进行细胞铺板，细胞铺板的密度为1x10⁵cells/100μL/孔；

S3、将以CD3为靶点的抗体药物进行浓度梯度稀释，起始浓度为300μg/ml，梯度稀释后，每孔50μL加入板中，同时在37℃温箱内孵育4-5小时后取出，备用；所述以CD3为靶点的抗体药物的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

S4、将孵育后的溶液进行离心并收集细胞沉淀，加入裂解液充分裂解后，与等体积的萤光素酶底物混合均匀，室温反应3-7min后，酶标仪在492nm波长下读取荧光值，间接检测NFAT活化因子诱导表达的萤光酶浓度，同时绘制荧光值-药物浓度曲线，并用于评价T细胞激活程度，所述裂解液为SDS裂解液；

所述检测方法还包括对步骤S1中构建的所述工程细胞株Jurkat-NFAT-Luc的检测，具体包括以下方法：

(1)对所述工程细胞株Jurkat-NFAT-Luc细胞铺板，1x10⁵cells/100μL/孔，设置空白对照组和实验组，所述实验组中每孔加入2μL的CD3/CD28激活磁珠或1μg/ml的抗CD3单克隆抗体，在37℃条件下孵育4-5小时后，收集细胞沉淀，备用；

(2)在所述细胞沉淀中加入裂解液室温反应10min，加入萤光素酶底物，酶标仪在492nm波长下读取荧光值，利用所述实验组除以所述空白对照组，计算荧光比值，选取荧光比值较高的克隆株扩增培养，即为阳性克隆株，所述荧光比值为所述实验组与所述空白对照组读取的荧光值的比值。

2.权利要求1所述的检测方法在含有抗CD3靶点的单克隆抗体、双特异抗体对T细胞激活程度检测中的应用。