[发明专利]一种以CD3为靶点的抗体药物对T细胞激活程度的检测方法

说明书

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种以CD3为靶点的抗体药物对T细胞激活程度的检测方法，该方法包括：构建并筛选稳定表达的工程细胞株；调整工程细胞株的细胞密度，进行细胞铺板；将以CD3为靶点的抗体药物进行浓度梯度稀释，孵育4‑5小时后；离心并收集沉淀，充分裂解后，与萤光素酶底物混合，读取荧光值，绘制荧光值‑药物浓度曲线。本发明通过检测NFAT诱导表达的萤光素酶表达水平来评价对T细胞激活程度，检测周期缩短到4‑5小时，缩短了检测周期，该方法中无需使用新鲜人血和检测试剂盒，节省了经济成本，操作方法简单，检测结果更加准确，可以广泛用于抗CD3单克隆抗体或双特异抗体对T细胞激活程度检测中的应用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种专门针对以CD3为靶点的抗体药物对T细胞激活程度的检测方法。

背景技术

细胞免疫是指由免疫细胞参与并发挥效应以清除抗原异物的作用，其分为非特异性免疫及特异性免疫。非特异性免疫是指物种长期进化发育而形成的一系列防御机制，主要参与其中的有上皮细胞(Epithelial Cell)、巨噬细胞(Macrophages，缩写为)、自然杀伤细胞(Natural killer cell，简称NK细胞)等；而特异性免疫主要由胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependent lymphocyte，简称T细胞)参与，由二类不同的细胞亚类参与，其中一种是迟发型超敏性的T细胞(主要为CD4+T)，该细胞和抗原起反应后可分泌细胞因子；另一种是细胞毒性T细胞(主要为CD8+T)，对靶细胞有特异杀伤作用。

T细胞激活活化进而增殖分化的过程，需要依靠“双信号”系统精密细致的调控，同时T细胞的活化需要有抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)的参与。巨噬细胞或树突状细胞通过吞噬等作用，将外源性蛋白摄入体内，经加工处理与自身的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子形成复合物，运送至T细胞表面，与T细胞表面的CD3/TCR复合物相互作用，形成第一信号；其次，T细胞上其他辅助分子如CD2、CD28、OX40及4-1BB等，可与APC上相应的配体分子如LF3、B7、TNFSF4及相关配体等结合，增强了T细胞与APC之间的连接，向T细胞传递协同刺激信号，使之活化。与此同时，T细胞上还有一些配体分子，如PD-1、CTLA-4，可与APC上相应的配体结合，抑制T细胞的活化。无论是刺激激活信号，还是结合抑制信号，均可统称为第二信号。两种信号分子相互配合，发挥增强或抑制T细胞的活性。

目前，针对CD3靶点的抗体药物在体外实验中均需要检测其对T细胞的激活程度，T细胞受体(T cell receptor，简称TCR)激活可促进许多信号转导并产生级联反应，进而调控细胞因子产物、细胞生存、增殖和分化等。首先TCR/CD3复合体胞膜内侧的免疫受体酪氨酸依赖性活化基序-(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，简称ITAM)磷酸化，随后启动并募集一系列不同家族酪氨酸激酶至TCR/CD3复合物处，进行磷酸化和激活，从而启动对下游接头蛋白或骨架蛋白的招募和磷酸化，促进招募一种可诱导T细胞的激酶(Itk)。磷脂酶Cγ1被Itk磷酸化后导致磷脂酰肌醇-4,5二磷酸的水解，产生第二信使甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。DAG激活PKCθ和MAPK/Erk两条信号通路，二者均可促进转录因子NF-κB活性。IP3触发Ca²⁺从内质网释放，并促使细胞外Ca²⁺通过钙离子释放活化通道进入细胞。钙离子结合的钙调蛋白激活钙调磷酸酶，后者通过活化T细胞核因子(nuclearfactor of activated T，NFAT)促进IL-2的基因转录。活化T细胞核因子(nuclear factorof activated T，NFAT)在免疫系统的发育、成熟和功能中发挥着关键作用，它们在多数免疫细胞中均有表达，并作为转录因子调节许多细胞因子(如IL-2、IFN-γ、GM-CSF等)、细胞表面配体(如CD40L和CD95L等)的表达。因此，NFAT报告基因可以用于检测细胞中NFAT调控的信号通路的活性。