[发明专利]来源于贝莱斯芽孢杆菌质粒的复制元件及其应用

说明书

本发明公开了来源于贝莱斯芽孢杆菌质粒的复制元件及其应用。本发明首先提供了从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明进一步将从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件应用于构建芽孢杆菌表达系统，将外源基因在芽孢杆菌中进行高效表达；进一步的，本发明提供了一种芽孢杆菌表达载体，包括启动子、在芽孢杆菌中进行自主复制的复制元件、在大肠杆菌中进行自主复制的复制元件以及在芽孢杆菌中表达的外源基因。应用本发明提供的复制元件能够介导外源基因在芽孢杆菌中高拷贝复制并高强度表达。

技术领域

本发明涉及构建芽孢杆菌高效表达系统的元件，尤其涉及来源于贝莱斯芽孢杆菌内生性质粒的用于构建芽孢杆菌高效表达系统的复制元件，属于芽孢杆菌表达系统的复制元件及其应用领域。

背景技术

芽孢杆菌属细菌因可形成抗逆性极强的内生孢子而在自然界中广泛分布，其中，杆菌枯草芽抱杆菌作为GARS（Generally Recognized as Safe）菌种之一，被广泛应用于食品、饲料等多个领域，有着巨大的经济、社会效益和生态效益（张慧等人，2019，热带植物学报，40：995–1001）。同时，枯草芽孢杆菌作为一个优良细胞工厂，能高效生产应用领域较广的酶蛋白（如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）（余晓霞等人，2015，生物技术通报，31：35–44），以枯草芽孢杆菌为宿主的蛋白表达系统是目前应用最广泛的表达系统之一。在枯草芽孢杆菌乃至芽孢杆菌的表达系统优化主要集中于高强度启动子挖掘和分泌信号肽筛选，诸多性能优异的启动子如P₄₃、P_sacB、P_xyl等相继被挖掘（余晓霞等人，2015，生物技术通报，31：35–44）。相对于启动子的多样性而言，用于构建芽孢杆菌表达载体的复制元件较为匮乏。研究表明，大部分枯草芽孢杆菌不含有内源性质粒，目前枯草芽孢杆菌表达系统的表达载体主要由葡萄球菌和链球菌内源性质粒（包括pUB110、pC194、pE194和 pT181）改造而来（Yang等人，2006，Biotechnology Letters，28：1713–1718；Kunst等人，1997，Nature，390：249–256），因此，深入挖掘可在芽孢杆菌中行使复制功能的元件有着重要现实需求和应用前景。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）为厚壁菌门、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，具有抗菌谱广、生长迅速、易分离培养、抗逆性强和生物安全性高等优点，在众多行业中被广泛应用。贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌亲缘性很高，贝莱斯芽孢杆菌来源的质粒及其复制元件在枯草芽孢杆菌中往往具有生物学功能。据报道，80%贝莱斯菌株中不含有内生性质粒（Grady等人，2019，BMC Microbiology，19：5）。因此，如果能够从贝莱斯菌株中发现内生性质粒并一步分离鉴定质粒复制的元件对于构建贝莱斯芽孢杆菌乃至芽孢杆菌高效表达系统均具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是从贝莱斯菌株中发现内生性质粒并一步分离鉴定质粒的复制元件；

本发明的目的之二是将从贝莱斯菌株中分离鉴定的质粒复制元件应用于芽孢杆菌表达载体的复制元件。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。